Oikopleura dioica является туникат модель организма в различных областях биологии. Мы описываем методы отбора проб, идентификацию видов, культивирование установки и культивирование протоколов для животных и водорослей корма. Мы выделяем ключевые факторы, которые помогли укрепить систему культуры и обсудить возможные проблемы и резолюции.
Oikopleura dioica – это планктонный хордат с исключительной способностью к подаче фильтров, быстрым временем генерации, сохранением раннего развития и компактным геномом. По этим причинам он считается полезным модельным организмом для морских экологических исследований, эволюционной биологии развития и геномики. Поскольку исследования часто требуют постоянного снабжения животными ресурсами, полезно создать надежную систему культуры с низким уровнем обслуживания. Здесь мы описываем пошаговый метод создания культуры O. dioica. Мы описываем, как выбрать потенциальные места отбора проб, методы сбора, целевую идентификацию животных и настройку системы культивирования. Мы предоставляем советы по устранению неполадок, основываясь на собственном опыте. Мы также выделяем критические факторы, которые помогают поддерживать надежную систему культуры. Хотя культурный протокол, представленный здесь, оптимизирован для O. dioica,мы надеемся, что наша техника отбора проб и культура установки будет вдохновлять новые идеи для поддержания других хрупких пелагических беспозвоночных.
Модельные организмы сыграли важную роль в решении многих биологических вопросов, включая вопросы, связанные с развитием, генетикой и физиологией. Кроме того, дополнительные модельные организмы способствуют новым открытиям и, следовательно, имеют решающее значение для достижения более глубокого понимания природы1,2. Морской зоопланктон представляют собой различные группы организмов, которые играют важную роль в океанических экосистемах3,,4,,5,,6. Несмотря на их изобилие и экологическое значение, желатиновые организмы, такие как планктонные туникаты, часто недопредставлены в исследованиях биоразнообразия планктона, потому что их прозрачность и хрупкость делают сбор поля и идентификациюсложными 7,8. Адаптированные методы отбора проб и лабораторное культивирование позволяют более внимательно наблюдать за животными in vitro, что способствовало знанию в биологии планктонных туникат9,,10,,11,,12.
Larvaceans (Аппендикулярные) являются класс свободного плавания морских туникат, состоящий из около 70 описанных видов во всем мире8,13. Поскольку они являются одной из наиболее распространенных групп в зоопланктонных сообществ14,15,16,17, larvaceans представляют собой основной источник пищи для крупных планктонных организмов, таких как личинки рыб18,19. В отличие от асцидий-sessile tunicates-larvaceans сохранить головастик, как морфология и остаются планктонные на протяжении всей своей жизни20. Каждое животное живет внутри самостроя, замысловатого фильтра кормления структуры, известной как дом. Они накапливают частицы в своих домах, создавая водные потоки через волнообразное движение их хвостов21. Забитые дома отбрасываются в течение дня, некоторые из которых образуют углеродные агрегаты и в конечном итоге опускаются на морское дно22; таким образом, larvaceans играют важную роль в глобальном потоке углерода23. Большинство видов, как сообщается, живут в пелагической зоне в верхней 100 м от водной колонки13; однако, гигантский ларвакейский Bathochordaeus, как известно, населяют глубины 300 м24. Исследование на Bathochordaeus в Монтерей-Бей, Калифорния показало, что животные также служат в качестве биологического вектора микропластика, предлагая потенциальную важность в понимании роли апендикулярных в вертикальном транспорте и распределении микропластика в океанах25.
Oikopleura dioica, вид larvacean, привлекает внимание в последние годы в качестве модели организма из-за нескольких замечательных характеристик. Об этом обычно сообщается во всех океанах мира. Особенно обильный в прибрежных водах26,что позволяет легко отбирать пробы с берега. Долгосрочное, стабильное культивирование возможно как с естественной, так и с искусственной морскойводой 27,,28,,29. Температурное время генерации в лабораторных условиях превышает 4-9 дней. Он имеет высокую плодовитость с каждой женщиной, способной производить 300 яиц в течение года. Как туникат, он занимает важное филогенетическое положение для понимания хорда эволюции30,31. На 70 Мб, O. dioica имеет самый маленький идентифицированный геном среди всех хордат32. Среди larvaceans, O. dioica является единственным описанным не-гермафродитических видов до сих пор33.
Первый успешный O. dioica культуры с лабораторно выращенных микроводорослей было сообщено Paffenh’fer34. Оригинальный протокол культуры с использованием синхронных двигателей и весла был разработан Fenaux и Gorsky35, а затем принят несколькими лабораториями. Совсем недавно Fujii et al.36 сообщили о том, что компания O. dioica культивирует искусственную морскую воду, надежную систему культуры и полевую коллекцию были описаны Bouquet et al.27, а оптимизированный протокол для упрощенной доступной системы был зарегистрирован Марти-Соланс и др.29. Помимо традиционной системы культуры Oikopleura, недавно сообщили дизайн с двойной трубки воспитания танк также имеет потенциал для культуры Oikopleura sp. 37.
Мы представляем подробный протокол для инициирования монокультуры O. dioica на основе сочетания протоколов, разработанных крупными исследовательскими группами Oikopleura в Международном центре морской молекулярной биологииСарса 27, Университет Барселоны29, Университет Осаки28, и наши собственные наблюдения. В ранее опубликованных протоколах культуры, подробная информация о составе водорослей средств массовой информации, методы отбора проб на берегу, и Oikopleura идентификации были лишь грубо описаны, оставляя много двусмысленности. Здесь, с помощью визуальной информации в видео-протоколе, мы собрали всю важную информацию, необходимую для создания культуры O. dioica с нуля в простой, шаг за шагом образом. Мы описываем, как отличить O. dioica от другого обычно сообщаемого вида, O. longicauda, который является одним из самых сложных шагов. Хотя существующие системы культуры применимы для выращивания O. dioica во всем мире, мы подчеркиваем важность корректировки протокола, основанной на местных экологических условиях. Представленная информация сочетает в себе широко опубликованные данные, а также знания, полученные на основе опыта. Текущий протокол идеально подходит для исследователей, заинтересованных в создании культуры с нуля.
Для облегчения гибкости в создании культуры O. dioica важно понимать естественную среду обитания животных. Сезонные данные предоставляют информацию о диапазонах физических параметров, которые могут быть использованы для руководства лабораторных условий культивирования. Это также помогает в понимании сезонных колебаний в изобилии животных. На Окинаве, O. dioica наиболее надежно найти с июня по октябрь. Тем не менее, в Токийском заливе, население пик в феврале и октябре41. Хотя культивирование O. dioica часто сообщается при температуре 20 градусов по Цельсию или ниже27,28,29, Okinawan O. dioica показывает лучшую выживаемость при температурах выше 20 градусов по Цельсию; это может быть объяснено тем фактом, что минимальная температура поверхностной морской воды на Окинаве составляет 20 градусов по Цельсию(рисунок 6). Обилие O. dioica также может быть под влиянием фитопланктона цветет42 и хищник изобилия43,44. Независимо от того, где O. dioica собраны, понимание сезонности местного населения максимизирует шансы выборки и культивирования успеха.
Учитывая соответствующий сезон и место, чистая выборка является эффективным способом сбора большого количества Oikopleura с минимальными усилиями. Для сбора всех этапов животного могут быть использованы планктонные сети с меньшим размером сетки (60-70 мкм). Полностью зрелые животные редко встречаются в сети, возможно, из-за их хрупкости в конце жизненного цикла. Таким образом, идентификация видов с последующей выборкой достигается путем микроскопического наблюдения подборальных клеток. Зрелые люди обычно появляются один или два дня после отбора проб, как животные продолжают расти в лаборатории. Хотя чистая выборка эффективна, альтернативные методы отбора проб могут быть необходимы в различных обстоятельствах. Например, чистая выборка вблизи городских районов может собрать большое количество фитопланктона, что затрудняет изоляцию Ойкоплеуры. В таких случаях рекомендуется простой отбор проб ведер для сбора поверхностного морского воды или пробы лодки из районов за пределами гавани. Результаты показали, что постепенное изменение солености из-за последовательных дней дождя не повлияло на обилие O. dioica; однако следует избегать отбора проб на берегах сразу же после экстремальных погодных явлений, таких, как тропические циклоны. Эти события вызывают внезапные и радикальные биогеохимические изменения в защищенном водоеме45,,46. Сток ливневых вод может нести загрязняющие вещества, отложения и избыток питательных веществ, которые повышают мутность и более низкое качествоводы 47. Планктон, питающийся фильтром, такой как Oikopleura,может быть особенно восприимчив к этим изменениям из-за их способа кормления и ограниченной подвижности. В таких обстоятельствах мы рекомендуем отложить отбор проб на несколько дней, пока местные условия не нормализутся.
Внедрение многоступенчатой системы фильтров имеет важное значение для поддержания малых, фильтр-кормления организмов, таких как O. dioica. Используя плохо отфильтрованную морскую воду (например, сетку размером 25 мкм в прежней системе культуры) культура часто была нестабильной, особенно в летнее время, что потенциально объясняется более высоким изобилием фитопланктона. Хотя некоторые фитопланктона полезны для роста O. dioica, другие производят биотоксины, которые могут вызвать аномальное развитие эмбрионов O. dioica 48. Кроме того, высокая концентрация диатомовых, таких как Chaetoceros spp. потенциально вредны для роста O. dioica, поскольку они могут обладать длинными сетами, которые могут засорить дом и предотвратить эффективное кормление49. Мы часто наблюдали, как дома мелких животных забиты C. calcitrans setae; Поэтому мы теперь кормим C. calcitrans только животным в День 2 и старше(Таблица 3).
Хотя это не было проблемой здесь, небольшие долгосрочные культивирования O. dioica может испытывать внезапное падение численности населения из-за генетического узкого места; в таких случаях, Марти-Соланс и др.29 рекомендуют добавлять новых диких людей в культуру каждые 20 поколений.
Система культуры Ойкоплеура является гибкой. Стабильная культура может быть установлена в течение недели. Долгосрочное культивирование O. dioica возможно на скромный бюджет с неспециалистным оборудованием. Ежедневные усилия, необходимые для обслуживания 5-10 стаканов Oikopleura, как правило, менее 2 часов с 2 человек. O. dioica также может поддерживаться в искусственной морской воде, что полезно для тех, кто не имеет доступа к естественной морскойводе 28. Долгосрочное хранение водорослей можно использовать с помощью твердой культуры и криоконсервации29. Кроме того, O. dioica спермы может быть криоконсерваны, и остаются жизнеспособными в течение более года50. Все эти факторы означают, что культуры могут быть легко восстановлены. Наконец, прошлый опыт с случайной культивирования Pleurobrachia SP. может предположить, что система культивирования, разработанная для Ойкоплеуры, потенциально может быть распространена на более широкое сообщество хрупких пелагических организмов.
O. dioica продолжает давать мощные знания о различных биологических областях. Понимание местной сезонности, тщательной системы культуры, и несколько преданных своему делу людей позволяют эффективной культуры, которые будут созданы с небольшим усилием. Система культуры Ойкоплеура предоставляет базовые ресурсы для изучения широкого спектра биологических областей, связанных с экологией, развитием, геномикой и эволюцией этого уникального морского хордата.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Гарту Ильсли за его поддержку в создании системы культуры. Мы признаем вклад Рицуко Суямы и Сильвена Гийо в усилия по раннему отбору проб и идентификации видов. Особая благодарность благодаря Хироки Нисида, Такеши Онума и Тацуя Омотезако за их щедрую поддержку и руководство во всем, в том числе первоначальное создание местной системы культивирования и обмена животными и микроалгалной культурой. Мы также благодарим Даниэля Чоррута, Юан-Мари Буке, Анну Аасорд, Кристиана Каньестро и Альфонсо Феррендес-Ролдана за то, что они поделились своим опытом в области отбора проб и культивирования. Джай Дентон, Чарльз Плесси и Джеффри Джолли предоставили бесценную обратную связь по рукописи. Шарлотта Уэст сформулировала обобщенное уравнение для расчета водорослей. Наконец, мы благодарим OIST за финансирование, Мэри Коллинз и OIST Fieldwork Комитет по безопасности за консультации по безопасным процедурам отбора проб, сотрудники OIST машинного цеха для строительства культивирования и отбора проб оборудования, и Koichi Тода для доставки морской воды.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |