דיוקולורה היא אורגניזם מודל מטונלי בתחומי הביולוגיה השונים. אנו מתארים שיטות דגימה, זיהוי מינים, התקנת culturing, ו culturing פרוטוקולים עבור בעלי חיים והזנה פריחת אצות. אנו מדגישים גורמי מפתח שסייעו לחזק את מערכת התרבות ולדון בבעיות וברזולוציות האפשריות.
הקבוצה של אויקוקולורה היא דמית המטוס עם יכולת יוצאת דופן האכלה מסנן, זמן דור מהיר, שימור מוקדם התפתחות, ו הגנום קומפקטית. מסיבות אלו, הוא נחשב לאורגניזם מודל שימושי למחקרים אקולוגיים ימיים, ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית וגנומיקה. כאשר מחקרים דורשים לעתים קרובות אספקה קבועה של משאבי בעלי חיים, זה שימושי להקים מערכת התרבות אמין, תחזוקה נמוכה. כאן נתאר שיטת צעד-אחר-צעד להקמת תרבות של א. דו . אנו מתארים כיצד לבחור אתרי דגימה פוטנציאליים, שיטות איסוף, זיהוי בעלי חיים היעד, ואת הגדרת מערכת culturing. אנו מספקים ייעוץ לפתרון בעיות בהתבסס על ההתנסויות שלנו. כמו כן אנו מדגישים גורמים קריטיים המסייעים לקיים מערכת תרבותית חזקה. למרות שפרוטוקול התרבות שסופק כאן הוא מיטבי עבור O. דיואיקה, אנו מקווים שטכניקת הדגימה והגדרת התרבות שלנו תעודד רעיונות חדשים לשמירת חסרי חוליות שבירים אחרים.
אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי בטיפול בשאלות ביולוגיות רבות כולל אלה הנוגעים פיתוח, גנטיקה, ופיזיולוגיה. יתר על כן, אורגניזמים נוספים מודל להקל על גילויים חדשים ולכן הם חיוניים כדי להשיג הבנה גדולה יותר של הטבע1,2. זואופלנקטון ימיים הם קבוצות מגוונות של אורגניזמים לשחק תפקיד חשוב באוקיינוס האקולוגית3,4,5,6. למרות השפע והחשיבות האקולוגית שלהם, אורגניזמים של ז’לטין כגון מינהור פלנקטון הם לעתים קרובות תחת מיוצגים במחקרים פלנקטון ביולוגי משום שקיפות שלהם שברישלהם להפוך את אוסף השדה ואת הזיהוי מאתגרת7,8. טכניקות דגימה מותאם ומעבדה לאפשר התבוננות מקרוב של בעלי החיים בתוך מבחנה, אשר הפכה את הידע בביולוגיה של מינהור פלנקטון9,10,11,12.
לאראמיאות (נספחים) הם מחלקה של שחייה ימית ללא תשלום הכוללת כ-70 מינים שתוארו ברחבי העולם8,13. כפי שהם אחת הקבוצות הנפוצות ביותר בתוך זואופלנקטון קהילות14,15,16,17, לאראמיאות מייצגים מקור מזון עיקרי לאורגניזמים גדולים פלנקטון כגון הזחלים דגים18,19. בניגוד לבני-הזוג-מורפולוגיה, שומרות על המבנה של ראשן, ונשארים מפלקוניים לאורך כל חייהם20. כל חיה מתגוררת בתוך מבנה מורכב, הניזון ממסננים, הידוע כבית. הם מצטברים חלקיקים בבתיהם על ידי יצירת זרמי מים דרך התנועה גלית של זנבות שלהם21. בתים סתומים נמחקים לאורך כל היום, שחלקם יוצרים אגרגטים פחמן ובסופו של דבר לשקוע אל קרקעית הים22; כך, לאראמיאות לשחק תפקיד מרכזי השטף פחמן גלובלי23. רוב המינים מדווחים לחיות באזור פלזה בתוך 100 העליון של העמודה המים13; עם זאת, הענק הגדול הבאוורצ מכונה לאכלס את מעמקי 300 m24. מחקר על האמבטיה במונטריי ביי, קליפורניה חשפה כי בעלי החיים משמשים גם וקטור ביולוגי של microplastics, מציע חשיבות פוטנציאלית בהבנת התפקיד של נספחים בתחבורה האנכית והפצה של microplastics באוקיינוסים25.
בשנים האחרונות כאורגניזם מודל,מושך את תשומת הלב בשנה האחרונה למודל בגלל כמה מאפיינים יוצאי דופן. הוא מדווח בדרך כלל ברחבי האוקיינוסים בעולם. הוא בשפע במים החוף26, אשר מאפשר דגימה קלה מן החוף. לטווח ארוך, מעגלי יציבה אפשרי עם מי-ים טבעיים ומלאכותיים27,28,29. זמני הייצור התלויים בטמפרטורה קצרים כמו 4-9 ימים בתנאי מעבדה. היא בעלת פוריות גבוהה עם כל נקבה המסוגלת לייצר > 300 ביצים לאורך כל השנה. כמו tunicate, זה תופס עמדה פילוגנטי חשובה להבנת אבולוציה מיתרניים30,31. ב 70 מגה, O. דיואיקה יש את הגנום הקטן ביותר שזוהו בין כל chordates32. בקרב לאראמואים, או. דיואיקה הינו המינים היחידים שאינם מהדיכודסטיים עד כה33.
התרבות הראשונה בעלת מיקרואצות מPaffenhöfer במעבדה, דווחה על ידי ה- 34. פרוטוקול התרבות המקורי באמצעות מנועים סינכרוניים ומשוטים פותחה על ידי Fenaux ו גורסקי35 ומאוחר יותר אומצה על ידי מעבדות מרובות. לאחרונה, Fujii et al.36 דיווח O. דו כאניקה בתוך מי ים מלאכותיים, מערכת תרבות חזקה ואוסף השדה תוארו על ידי זר והפרוטוקול ממוטב עבור מערכת פשוטה, במחיר סביר דיווחו על ידי מארטי-solansואח ‘ 29. מלבד מערכת התרבות המסורתית אויקוקולורה , עיצוב חדש שדווחו עם מיכל גידול כפול של שפופרת יש גם את הפוטנציאל לתרבות אויקופליורה sp. 37.
אנו מציגים פרוטוקול מפורט לייזום מונואולית O. הדו המבוססת על שילוב של פרוטוקולים שפותחו על ידי קבוצות מחקר של אויקויורה העיקרי בבית הסארס הבינלאומי לביולוגיה מולקולרית של ימית27, אוניברסיטת ברצלונה29, אוניברסיטת אוסקה28, ותצפיות שלנו. בפרוטוקולי התרבות שפורסמו בעבר, מידע מפורט על ההרכב של פריחת אצות מדיה, שיטות דיגום החוף, וזיהוי אויקופליורה היו רק מתוארים בערך, השארת הרבה בהירות. כאן, בעזרת מידע חזותי בפרוטוקול וידאו, הרכבנו את כל המידע הקריטי הדרוש כדי להקים תרבות O. דיוקה מהיסוד באופן פשוט, צעד אחר צעד. אנו מתארים כיצד להבדיל o. דיואיקה ממינים אחרים שבדרך כלל דיווחו, O. longicauda, שהוא אחד השלבים המאתגרים ביותר. למרות שמערכות התרבות הקיימות חלות על הטיפוח של O. דיוקה ברחבי העולם, אנו מדגישים את חשיבות התאמת הפרוטוקולים המבוססת על תנאים סביבתיים מקומיים. המידע המוצג משלב נתונים שפורסמו באופן נרחב וכן ידע שהושג באמצעות התנסות. הפרוטוקול הנוכחי מתאים באופן אידיאלי לחוקרים המעוניינים להקים תרבות מבראשית.
כדי להקל על הגמישות בהקמת תרבות O ‘ דיוקה , חשוב להבין את הסביבה הטבעית של בעלי החיים. נתונים עונתיים מספקים מידע על טווחים של פרמטרים פיזיים, אשר ניתן להשתמש כדי להנחות את התנאים culturing מעבדה. היא גם מסייעת להבנת תנודות עונתיות בשפע של בעלי חיים. באוקינווה, O. דיואיקה נמצא באופן האמין ביותר מיוני עד אוקטובר. עם זאת, במפרץ טוקיו, אוכלוסיות שיא בפברואר ובאוקטובר41. למרות שהקולטיורינג של או. דיואיקה מדווחים לעתים קרובות ב-20 מעלותצלזיוס או27התחתונות,28,29, אוקינאווה O. דיואיקה מראה הישרדות טובה יותר בטמפרטורות מעל 20 ° c; זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה את הטמפרטורה מינימום מי ים באוקינווה הוא ~ 20 ° צ’ (איור 6). השפע של O. דיואיקה עשוי להיות מושפע גם על ידי פיטופלנקטון פורח42 ו טורף שפע43,44. ללא קשר למקום שבו נאספים O. דיוצה , הבנת העונתיות של האוכלוסיות המקומיות מגדילה את הסיכוי להצלחה בדיגום והצלחה.
בהינתן העונה והמיקום המתאימים, הדגימה הנטו היא דרך יעילה לאסוף מספר גדול של אויקופאורה עם מאמץ מינימלי. רשתות פלנקטון עם גודל שינוי קטן יותר (60-70 μm) עשוי לשמש גם כדי לאסוף את כל שלבי החיות. חיות בוגרות לחלוטין מצויים ברשת, אולי בשל שבריתם בסוף מחזור החיים. לכן, זיהוי המינים ולאחריו דגימה מושגת על ידי התבוננות מיקרוסקופית של תאים subchordal. אנשים מבוגרים בדרך כלל מופיעים יומיים או יומיים לאחר הדגימה כבעלי חיים ממשיכים לצמוח במעבדה. למרות שדגימה נטו יעילה, שיטות דגימה חלופיות עשויות להיות נחוצות בנסיבות שונות. לדוגמה, דגימה נטו ליד אזורים עירוניים יכולה לאסוף מספר רב של פיטופלנקטון, מה שמקשה על הבידוד של אויקופורה. במקרים כאלה, מדגם דלי פשוט לאיסוף מי ים או דגימת סירה מאזורים שמעבר לנמל מומלצים. התוצאות הראו כי השינוי ההדרגתי במליחות עקב ימי גשם רצופים לא השפיע על השפע של O. דיואיקה; עם זאת, החוף דגימה מיד לאחר אירועי מזג אוויר קיצוניים כגון ציקלונים טרופיים צריך להימנע. אירועים אלה גורמים שינויים ביוגיאוכימיים פתאומי ודרסטי בגוף מוגן של מים45,46. מי שנגר הסער עשוי לשאת מזהמים, משקעים וחומרים מזינים עודפים, המגבירים את העכירות ואת איכות המים הנמוכה47. פלנקטון של האכלה מסננים, כגון אויקופלירה, עשויים להיות רגישים במיוחד לשינויים אלה עקב מצב של האכלה וניידות מוגבלת. בנסיבות כאלה, אנו ממליצים לדחות את הדגימה לכמה ימים עד שהתנאים המקומיים יחזרו למסלולם.
המבוא של מערכת סינון מרובת שלבים חיוני לשמור על אורגניזמים קטנים, האכלה מסננים כגון O. דיואיקה. באמצעות מי ים מסוננים למדי (למשל, a 25 יקרומטר רשת במערכת התרבות הקודמת), התרבות היתה לעתים קרובות לא יציבה במיוחד במהלך הקיץ, בגלל השפע הגבוה של פיטופלנקטון. למרות שחלק מהפיטופלנקטון מועילים לצמיחה של o. דיוקה , אחרים מייצרים ביוטוקסינים שעלולים לגרום להתפתחות חריגה של עוברי O. דיוקה 48. בנוסף, ריכוז גבוה של אלהלמה כגון chaetoceros spp. הם עלולים להזיק O. דיואיקה צמיחה כפי שהם יכולים להחזיק setae ארוכה אשר יכול לסתום את הבית ולמנוע האכלה יעילה49. לעתים קרובות הבחנו בבתים של בעלי חיים קטנים שסתומים על ידי C. calcitrans setae; לכן, אנו מאכילים כעת את C. calcitrans רק לבעלי חיים ביום 2 ומעלה (שולחן 3).
למרות שזאת לא היתה בעיה, לאורך זמן קטן לטווח הארוך של O. דיוניקה יכול לחוות טיפות פתאומיות בגודל האוכלוסייה בגלל צוואר בקבוק גנטי; במקרים כאלה, מרטינו-סולאנים ואח ‘29 ממליצים להוסיף אנשים פראיים חדשים לתרבות כל 20 דורות.
מערכת התרבות של אויקופורה היא גמישה. ניתן להקים תרבות יציבה תוך שבוע. מגוון לטווח ארוך של O. הינו אפשרי בתקציב צנוע עם ציוד לא מומחה. המאמץ היומיומי הנדרש לתחזוקת 5-10 הספלים של אויקופורה הוא בדרך כלל פחות מ 2 שעות עם 2 אנשים. כמו כן ניתן לשמור על הצמח במי ים מלאכותיים, שיועיל לאלה ללא גישה למי ים טבעיים28. אחסון לטווח ארוך של מזון פריחת אצות אפשרי באמצעות התרבות המוצק ו הקריוגנית29. כמו-כן, ניתן להוריד את הזרע בזרעים של או, ולהישאר מסוגלים ליותר משנה50. כל הגורמים הללו מתכוונים כי התרבויות ניתן להקים מחדש בקלות. בסופו של דבר, ניסיון העבר עם מקרי בשוגג של פלאורורכיה sp. עשוי להציע כי מערכת culturing שפותחה עבור אויקופורה יכול להיות מורחב לקהילה רחבה יותר של אורגניזמים הפלחיים שבירים.
O. דיוקה ממשיכה לספק תובנות חזקות לתחומים ביולוגיים שונים. הבנה של העונתיות המקומית, מערכת התרבות הדקדקנית, ומספר אנשים מסורים מאפשרים לתרבות יעילה להיות מבוסס עם מעט מאמץ. מערכת התרבות אויקופורה מספקת את המשאבים הבסיסיים לחקור מגוון רחב של שדות ביולוגיים הנוגעים לאקולוגיה, פיתוח, גנומיקה והתפתחות של הכאודייט הימי הייחודי הזה.
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה לגארת ‘ אילסלי על תמיכתו בהקמת מערכת התרבות. אנו מכירים את התרומות של ריצוקו סואיאמה ושל סילביין Guillot למאמצי הזיהוי המוקדמים של הדגימה והמינים. תודות מיוחדות הן בשל הירוקי נישידה, טאקשי ונאמה, וטאסואיה אוטקזאנו לתמיכה והדרכה נדיבות לאורך כל הדרך, כולל הקמתה הראשונית של מערכת הקולטיורינג המקומית ושיתוף בעלי חיים ותרבות מיקרואליגל. כמו כן, אנו מודים לדניאל כרורד, ז’אן-מארי זר, אן אג’יורד, כריסטיאן קאניטרו, ואלפונסו פרנדז-רולדן על שיתוף המומחיות שלהם בדיגום ובתפירה. ג’יי דנטון, צ’רלס פלסי, וג ג’ולי. סיפקו משוב לא יסולא בפז בכתב היד שרלוט ווסט ניסח משוואה כללית לחישוב פריחת אצות. בסופו של דבר, אנו מודים לווייס על מימון, מרי קולינס וועדת הבטיחות בעבודת השטח של העובדים לקבלת ייעוץ בנוגע להליכי דיגום בטוחים, הצוות של מכונת הקפה-מכונה לבניית הציוד הפולחני והדיגום, וקואיצ’י טודה בגין אספקת מי-ים.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |