Oikopleura dioica is een tunicate model organisme op verschillende gebieden van de biologie. We beschrijven bemonsteringsmethoden, soortenidentificatie, kweekopstelling en kweekprotocollen voor de dieren en algenvoer. We belichten belangrijke factoren die hebben bijgedragen aan de versterking van het cultuursysteem en het bespreken van de mogelijke problemen en oplossingen.
Oikopleura dioica is een planktonische chordate met uitzonderlijke filter-voeding vermogen, snelle generatie tijd, bewaard vroege ontwikkeling, en een compact genoom. Om deze redenen wordt het beschouwd als een nuttig modelorganisme voor mariene ecologische studies, evolutionaire ontwikkelingsbiologie en genomica. Aangezien onderzoek vaak een gestage aanvoer van dierlijke hulpbronnen vereist, is het nuttig om een betrouwbaar, onderhoudsarm cultuursysteem op te zetten. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode voor het opzetten van een O. dioica cultuur. We beschrijven hoe potentiële bemonsteringsplaatsen, verzamelmethoden, identificatie van dieren en de opzet van het kweeksysteem kunnen worden geselecteerd. We geven advies over het oplossen van problemen op basis van onze eigen ervaringen. We belichten ook kritische factoren die helpen om een robuust cultuursysteem in stand te houden. Hoewel het hier verstrekte cultuurprotocol is geoptimaliseerd voor O. dioica,hopen we dat onze samplingtechniek en cultuuropstelling nieuwe ideeën zullen inspireren voor het behoud van andere kwetsbare pelagische ongewervelde dieren.
Modelorganismen hebben veel biologische vragen aangepakt, waaronder die met betrekking tot ontwikkeling, genetica en fysiologie. Bovendien vergemakkelijken aanvullende modelorganismen nieuwe ontdekkingen en zijn daarom van cruciaal belang om een beter begrip van de natuur te bereiken1,2. Marien zoöplankton zijn diverse groepen organismen die een belangrijke rol spelen in oceaanecosystemen3,4,5,6. Ondanks hun overvloed en ecologisch belang, gelatineachtige organismen zoals plankton manieten zijn vaak ondervertegenwoordigd in plankton biodiversiteit studies, omdat hun transparantie en kwetsbaarheid maken veld collectie en identificatie uitdagend7,8. Aangepaste bemonsteringstechnieken en laboratoriumculten maken een betere observatie van de dieren in vitro mogelijk, die de kennis in de biologie van planktonionische man enelegaten9,10,11,12heeft bevorderen .
Larvaceans (Appendicularians) zijn een klasse van vrij zwemmende mariene manudieren bestaande uit ongeveer 70 beschreven soorten wereldwijd8,13. Aangezien zij een van de meest voorkomende groepen binnen zoöplanktongemeenschappen14,15,16,17, larvaceans vormen een primaire voedselbron voor grotere planktonorganismen zoals vislarven18,19. In tegenstelling tot ascidians-de sessile manuici-larves behouden een kikkervis-achtige morfologie en blijven planktoniek gedurende hun hele leven20. Elk dier leeft in een zelfgebouwde, ingewikkelde filter-feeding structuur bekend als een huis. Ze accumuleren deeltjes in hun huizen door het creëren van waterstromen door de golvende beweging van hun staarten21. Verstopte huizen worden gedurende de dag weggegooid, waarvan sommige koolstofaggregaten vormen en uiteindelijk zinken naar de zeebodem22; larvaceans spelen dus een belangrijke rol in de wereldwijde koolstofflux23. De meeste soorten worden gemeld om in de pelagische streek binnen de hogere 100 m van de waterkolom13te leven; echter, de reus larvacean Bathochordaeus is bekend dat de diepten van 300 m24bewonen. Een studie over Bathochordaeus in Monterey Bay, Californië bleek dat de dieren ook dienen als een biologische vector van microplastics, wat wijst op een potentieel belang in het begrijpen van de rol van blinden in het verticale transport en de distributie van microplastics in de oceanen25.
Oikopleura dioica, een soort larvacïteïsche, heeft de afgelopen jaren de aandacht getrokken als modelorganisme vanwege een aantal opmerkelijke kenmerken. Het wordt vaak gemeld in de oceanen van de wereld. Het is vooral overvloedig in kustwateren26, waardoor gemakkelijk te proeven vanaf de kust. Langdurige, stabiele kweek is mogelijk met zowel natuurlijk als kunstmatig zeewater27,28,29. Temperatuur afhankelijke generatie tijden zijn zo kort als 4-9 dagen in laboratoriumomstandigheden. Het heeft een hoge haalbaarheid met elk vrouwtje in staat om te produceren >300 eieren het hele jaar door. Als een tunicate, het neemt een belangrijke fylogenetische positie voor het begrijpen van chordate evolutie30,31. Met 70 Mb heeft O. dioica het kleinste geïdentificeerde genoom onder alle chordates32. Onder larvaceans, O. dioica is de enige beschreven niet-hermafrodiet soorten tot nu toe33.
De eerste succesvolle O. dioica cultuur met laboratorium gekweekte microalgen werd gemeld door Paffenhöfer34. Het oorspronkelijke cultuurprotocol met synchrone motoren en peddels werd ontwikkeld door Fenaux en Gorsky35 en later overgenomen door meerdere laboratoria. Meer recent, Fujii et al.36 gemeld O. dioica culturing in kunstmatig zeewater, een robuuste cultuur systeem en veld collectie werden beschreven door Bouquet et al.27 en een geoptimaliseerd protocol voor een vereenvoudigd, betaalbaar systeem werd gemeld door Marti-Solans et al.29. Afgezien van de traditionele Oikopleura cultuur systeem, een nieuw gemeld ontwerp met een dubbele buis opfok tank heeft ook het potentieel om cultuur Oikopleura sp. 37.
We presenteren een gedetailleerd protocol voor het initiëren van een O. dioica monocultuur op basis van een combinatie van protocollen ontwikkeld door grote Oikopleura onderzoeksgroepen aan het Sars International Centre for Marine Molecular Biology27,de Universiteit van Barcelona29, Osaka University28, en onze eigen waarnemingen. In eerder gepubliceerde cultuurprotocollen werden gedetailleerde informatie over de samenstelling van algenmedia, kustbemonsteringstechnieken en Oikopleura-identificatie slechts ruwweg beschreven, waardoor er veel onduidelijkheid overblijft. Hier, met behulp van visuele informatie in het videoprotocol, hebben we alle kritieke informatie verzameld die nodig is om een O. dioica-cultuur van de grond af op een eenvoudige, stapsgewijze manier op te zetten. We beschrijven hoe je O. dioica onderscheidt van een andere vaak gerapporteerde soort, O. longicauda, wat een van de meest uitdagende stappen is. Hoewel de bestaande cultuursystemen wereldwijd van toepassing zijn op de teelt van O. dioica, benadrukken we het belang van protocolaanpassing op basis van lokale omgevingsomstandigheden. De gepresenteerde informatie combineert op grote schaal gepubliceerde gegevens en kennis opgedaan door ervaring. Het huidige protocol is bij uitstek geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vestigen van een cultuur vanaf nul.
Om de flexibiliteit bij de vestiging van de O. dioicacultuur te vergemakkelijken, is het belangrijk om de natuurlijke habitat van de dieren te begrijpen. Seizoensgegevens geven informatie over het bereik van fysieke parameters, die kunnen worden gebruikt om laboratoriumcultusomstandigheden te begeleiden. Het helpt ook bij het begrijpen van seizoensgebonden schommelingen in de overvloed aan dieren. In Okinawa, O. dioica is het meest betrouwbaar gevonden van juni tot oktober. Echter, in De baai van Tokio, bevolking piek in februari en41oktober . Hoewel het kweken van O. dioica vaak wordt gemeld bij 20 °C of lager27,28,29, toont Okinawan O. dioica een betere overleving bij temperaturen boven de 20 °C; dit kan worden verklaard door het feit dat de minimumtemperatuur aan zeewater in Okinawa ~20 °C is (figuur 6). De overvloed aan O. dioica kan ook worden beïnvloed door fytoplanktonbloei42 en roofdierovervloed43,44. Ongeacht waar O. dioica worden verzameld, het begrijpen van de seizoensgebondenheid van de lokale bevolking maximaliseert de kans op bemonstering en het kweken van succes.
Gezien het juiste seizoen en de juiste locatie, netto bemonstering is een effectieve manier om grote aantallen Oikopleura te verzamelen met minimale inspanning. Planktonnetten met een kleinere maaswijdte (60-70 μm) kunnen ook worden gebruikt om alle stadia van de dieren te verzamelen. Volledig volwassen dieren worden zelden in het net aangetroffen, misschien vanwege hun kwetsbaarheid aan het einde van de levenscyclus. Daarom wordt de identificatie van soorten gevolgd door bemonstering bereikt door microscopische observatie van subchordalcellen. Volwassen individuen verschijnen meestal een of twee dagen na de bemonstering als dieren blijven groeien in het laboratorium. Hoewel de nettobemonstering efficiënt is, kunnen in verschillende omstandigheden alternatieve bemonsteringsmethoden nodig zijn. Bijvoorbeeld, netto bemonstering in de buurt van stedelijke gebieden kan verzamelen grote aantallen fytoplankton, waardoor het moeilijk is om Oikopleurate isoleren . In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om eenvoudige emmerbemonstering te verzamelen om oppervlaktezeewater of bootbemonstering te verzamelen uit gebieden buiten de haven. De resultaten toonden aan dat de geleidelijke verandering in het zoutgehalte als gevolg van opeenvolgende regendagen geen invloed had op de overvloed aan O. dioica; echter, kust bemonstering onmiddellijk na extreme weersomstandigheden zoals tropische cyclonen moeten worden vermeden. Deze gebeurtenissen veroorzaken plotselinge en drastische biogeochemische veranderingen in een beschut waterlichaam45,46. De afvoer van hemelwater kan verontreinigende stoffen, sedimenten en overtollige voedingsstoffen vervoeren, die troebelheid en lagere waterkwaliteit verhogen47. Filtervoedend plankton, zoals Oikopleura,kan bijzonder gevoelig zijn voor deze veranderingen als gevolg van hun wijze van voeding en beperkte mobiliteit. In een dergelijke omstandigheid raden we aan de bemonstering een paar dagen uit te stellen totdat de lokale omstandigheden weer normaal zijn.
De invoering van een multi-step filtersysteem is essentieel voor het behoud van kleine, filter-voedende organismen zoals O. dioica. Met behulp van slecht gefilterd zeewater (bijvoorbeeld een 25 μm mesh in het vorige cultuursysteem) was de cultuur vaak instabiel, vooral in de zomer, mogelijk door de hogere overvloed aan fytoplankton. Hoewel sommige fytoplankton gunstig zijn voor o. dioica groei, produceren anderen biotoxines die abnormale ontwikkeling van O. dioica embryo’s kunnen veroorzaken48. Bovendien is een hoge concentratie diatomeeën zoals Chaetoceros spp. potentieel schadelijk voor o. dioica groei als ze kunnen beschikken over lange setae die het huis kan verstoppen en te voorkomen dat efficiënte voeding49. We zagen vaak huizen van kleine dieren verstopt door C. calcitrans setae; daarom voeren we C. calcitrans nu alleen aan dieren op dag 2 en ouder(tabel 3).
Hoewel het hier geen probleem was, kan kleinschalige langdurige culturing van O. dioica plotselinge dalingen in bevolkingsomvang ervaren als gevolg van een genetisch knelpunt; in dergelijke gevallen, Martí-Solans et al.29 raden het toevoegen van nieuwe wilde individuen aan de cultuur om de 20 generaties.
Het Oikopleura cultuursysteem is flexibel. Binnen een week kan een stabiele cultuur tot stand komen. Lange termijn culturing van O. dioica is mogelijk op een bescheiden budget met niet-gespecialiseerde apparatuur. De dagelijkse inspanning die nodig is voor het onderhoud van 5-10 bekers van Oikopleura is over het algemeen minder dan 2 uur met 2 personen. O. dioica kan ook worden gehandhaafd in kunstmatig zeewater, wat gunstig is voor mensen zonder toegang tot natuurlijk zeewater28. Langdurige opslag van algenvoedsel is mogelijk met behulp van vaste cultuur en cryopreservatie29. Bovendien kan O. dioica sperma worden cryopreserved, en levensvatbaar blijven voor meer dan een jaar50. Al deze factoren betekenen dat culturen gemakkelijk kunnen worden hersteld. Tot slot, verleden ervaring met toevallige culturing van Pleurobrachia sp. kan suggereren dat het voor Oikopleura ontwikkelde kweeksysteem mogelijk kan worden uitgebreid tot een bredere gemeenschap van kwetsbare pelagische organismen.
O. dioica blijft krachtige inzichten bieden in verschillende biologische gebieden. Een goed begrip van lokale seizoensgebondenheid, een nauwgezet cultuursysteem en een paar toegewijde individuen maken het mogelijk om effectieve cultuur met weinig inspanning tot stand te brengen. Oikopleura cultuursysteem biedt de basismiddelen om een breed scala van biologische gebieden met betrekking tot ecologie, ontwikkeling, genomica, en de evolutie van deze unieke mariene chordaat te onderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
We zijn Garth Ilsley dankbaar voor zijn steun bij het opzetten van het cultuursysteem. We erkennen de bijdragen van Ritsuko Suyama en Sylvain Guillot aan vroege inspanningen op het nemen van monsters en soortenidentificatie. Speciale dank is te danken aan Hiroki Nishida, Takeshi Onuma, en Tatsuya Omotezako voor hun genereuze steun en begeleiding in de hele, met inbegrip van de eerste oprichting van de lokale kweeksysteem en het delen van dieren en microalgal cultuur. We danken ook Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro en Alfonso Ferrández-Roldán voor het delen van hun expertise op het gebied van sampling en culturing. Jai Denton, Charles Plessy en Jeffrey Jolly gaven waardevolle feedback over het manuscript. Charlotte West formuleerde een algemene vergelijking voor algenberekening. Tot slot danken we OIST voor de financiering, Mary Collins en het OIST Fieldwork Safety Committee voor advies over veilige bemonsteringsprocedures, het personeel van OIST-machinewinkel voor de bouw van kweek- en bemonsteringsapparatuur, en Koichi Toda voor het leveren van zeewater.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |