オイコプレウラ・ジオカは、生物学の様々な分野でのチュニケートモデル生物です。我々は、動物および藻類飼料のサンプリング方法、種同定、培養セットアップ、および培養プロトコルについて述べる。文化システムの強化に役立つ重要な要因を強調し、考えられる問題と解決について議論します。
オイコプレウラ・ジオカは、フィルター供給能力、迅速な生成時間、保存初期の開発、およびコンパクトなゲノムを備えたプランクトニック・コルデートです。これらの理由から、海洋生態学的研究、進化発生生物学、ゲノミクスにとって有用なモデル生物と考えられています。研究は、多くの場合、動物資源の安定供給を必要とするため、信頼性の高い、低メンテナンスの培養システムを確立することが有用です。ここでは、O.ジオカ文化を確立するためのステップバイステップの方法について説明します。潜在的なサンプリング部位の選択方法、収集方法、標的動物同定、培養システムのセットアップ方法について説明する。私たちは、独自の経験に基づいてトラブルシューティングのアドバイスを提供します。我々はまた、強固な文化システムを維持するのに役立つ重要な要因を強調する。ここで提供される文化プロトコルはO.dioica用に最適化されていますが、サンプリング技術と培養のセットアップが他の脆弱な遠視無脊椎動物を維持するための新しいアイデアを刺激することを願っています。
モデル生物は、開発、遺伝学、生理学に関する問題を含む多くの生物学的問題に取り組んできました。さらに、追加のモデル生物は新しい発見を促進し、したがって、自然の理解を深めるために重要である1,,2.海洋動物プランクトンは、海洋生態系3、4、5、64,5において重要な役割3を果たす生物の多様なグループである6。その豊富さと生態学的重要性にもかかわらず、プランクトンチュニケートのようなゼラチン性生物は、その透明性と脆弱さがフィールドコレクションと識別を77,8に挑戦させるため、プランクトン生物多様性研究では過小評価されることが多い。適応されたサンプリング技術と実験室培養は、植物の詳細な観察を可能にする、プランクトニックチュニケート99、10、11、1210,11,12の生物学における知識を促進している。
ラーバセアン(虫垂家)は、世界中で約70種の記載された種を含む自由に泳ぐ海洋チュニケートのクラス8、1313である。彼らは動物プランクトンコミュニティ内で最も豊富なグループの一つであるとして 14,,15,,16,,17,幼虫は、魚の幼虫などの大きなプランクトン生物のための主要な食料源を表す18,,19.ascidiansとは異なり、セシルチュニケート-幼虫はオタマジャクシのような形態を保持し、生涯を通じてプランクトニックなまま20.各動物は、家として知られている自作の複雑なフィルター給餌構造の中に住んでいます。彼らは尾21の起伏のある動きを通して水流を作り出すことによって、家の中に微粒子を蓄積する。詰まった家屋は一日を通して廃棄され、そのうちのいくつかは炭素凝集体を形成し、最終的には海底22に沈む。したがって、幼虫は世界的な炭素フラックス23において大きな役割を果たす。ほとんどの種は、水柱13の上100m以内の遠洋地帯に生息すると報告されている。しかし、巨大な幼虫バソシノエウスは300 m24の深さに生息することが知られています。カリフォルニア州モントレー湾のバソコルカエウスに関する研究は、動物がマイクロプラスチックの生物学的ベクターとしても機能することを明らかにし、海洋におけるマイクロプラスチックの垂直輸送および流通における虫垂家の役割を理解する上で潜在的な重要性を示唆した。
幼虫の一種であるオイコプレウラ・ジオカは、近年、いくつかの顕著な特徴により、モデル生物として注目を集めています。それは一般的に世界中の海で報告されています。海岸海域26に特に豊富に存在し、海岸からのサンプリングが容易です。長期的な安定した培養は、自然と人工海水27、28、2928,29の両方で可能です。27温度依存生成時間は、実験室条件で4〜9日と短い。年間を通じて300個の卵を生産できる女性一人一人と高い胎児性を持っています。チュニケートとして、それは、chordateの進化を理解するための重要な系統的位置を占める30,,31.70 Mbでは、O.dioicaは、すべてのchordates32の中で最も小さな同定されたゲノムを有する。幼虫の中で、O.ジオカは、これまで33の非雌雄同種の唯一の記載である。
実験室で成長した微細藻類との最初の成功したO.ジオカ文化は、Paffenhöfer34によって報告されました。同期モーターとパドルを使用したオリジナルの培養プロトコルは、フェノーとゴルスキー35によって開発され、後に複数の研究所で採用されました。最近では、Fujiiら36は人工海水中でのO.ジオカ培養を報告し、堅牢な培養システムとフィールドコレクションはBouquetららによって記述され、簡便で手頃な価格のシステムのための最適化されたプロトコルがMarti-Solansららによって報告された。伝統的なオイコプレラ文化システムとは別に、二重チューブ飼育タンクを備えた新たに報告されたデザインも、オイコプレウラspを培養する可能性を秘めています。37.
サルス国際海洋分子生物学センター27、バルセロナ大学29、大阪大学28、および私たち自身の観測で、主要なオイコプレラ研究グループが開発したプロトコルの組み合わせに基づいて、O.dioica単一培養を推進するための詳細なプロトコルを提示します。29以前に発表された培養プロトコルでは、藻類培地の組成、ショアサンプリング技術、オイコプレラ同定に関する詳細な情報は大まかに説明され、多くのあいまいさを残した。ここでは、ビデオプロトコルの視覚情報の助けを借りて、私たちは簡単なステップバイステップの方法で、最初からO.dioica文化を設定するために必要なすべての重要な情報を組み立てました。私たちは、O.ディオイカを、最も困難なステップの1つである別の一般的に報告された種、O.ロンジカウダと区別する方法を説明します。既存の文化システムは、世界各地でのO.dioicaの栽培に適用可能ですが、地域の環境条件に基づくプロトコル調整の重要性を強調しています。提示された情報は、広く公開されたデータと経験を通じて得られた知識を組み合わせたものです。現在のプロトコルは、文化をゼロから確立することに興味を持つ研究者に最適です。
O.ジオカ文化の確立の柔軟性を促進するためには、動物の自然の生息地を理解することが重要です。季節データは、実験室の培養条件を導くために使用できる物理的パラメータの範囲に関する情報を提供します。また、動物の豊富さの季節変動を理解するのに役立ちます。沖縄では、O.ディオイカが6月から10月まで最も確実に見つかる。しかし、東京湾では、2月と10月41日に人口がピークに達します。O.ジオカの培養は20°C以下27、28、2928,29で報告されることが多いが、沖縄O.ジオカは20°Cを超える温度でより良い生存率を示す。27沖縄の海面水の最低温度が~20°Cであるということで説明できるかもしれません(図6)。O.ジオカの豊富さも植物プランクトンの花42と捕食者の豊富さ43、44の影響を44受けるかもしれません。O.ジオカがどこで収集されているかに関係なく、地元の人々の季節性を理解することは、サンプリングと培養の成功のチャンスを最大化します。
適切な季節と場所を考えると、ネットサンプリングは最小限の労力で多数のオイコプレラを収集する効果的な方法です。小さいメッシュサイズ(60〜70 μm)のプランクトンネットは、動物のすべての段階を収集するためにも使用することができます。完全に成熟した動物は、おそらくライフサイクルの終わりにその脆弱性のために、ネットで見られることはめったにありません。したがって、種同定後のサンプリングは、脊体下細胞の顕微鏡観察によって達成される。成熟した個体は、通常、動物が実験室で成長し続けるにつれて、サンプリング後1〜2日に現れる。ネット サンプリングは効率的ですが、異なる状況で代替サンプリング方法が必要になる場合があります。例えば、都市部付近でのネットサンプリングは、植物プランクトンを大量に集めることが可能で、オイコプレウラを隔離することが困難である。このような場合には、港の向こうの領域から水面海水またはボートサンプリングを収集するための簡単なバケットサンプリングをお勧めします。結果は、連続した日の雨による食前の漸進的変化がO.ディオイカの豊富さに影響を与えなかったことを示した。しかし、熱帯低気圧などの極端な気象事象の直後に海岸をサンプリングすることは避けるべきです。これらの事象は、保護された水域45,46,46に突然の急激な生物地球化学的変化を引き起こす。雨水流出は、汚染物質、堆積物、過剰な栄養素を運び、濁度を増加させ、水質を低下させる47.オイコプレウラのようなフィルター給餌プランクトンは、摂食のモードと限られた移動性のためにこれらの変化の影響を受けやすいかもしれません。このような状況では、局所的な条件が正常に戻るまで数日間サンプリングを延期することをお勧めします。
O.dioicaのような小さなフィルター供給生物を維持するためには、多段階フィルタシステムの導入が不可欠です。不十分に濾過された海水(例えば、以前の培養系では25μmのメッシュ)を使用すると、特に夏期には植物プランクトンの豊富さが高いため、培養が不安定になることが多かった。いくつかの植物プランクトンは、O.ジオカの成長に有益であるが、他のがO.ジオイカ胚48の異常な発達を引き起こす可能性のあるビオトキシンを産生する。さらに、Chaetoceros spp.のような高濃度の珪藻は、家を詰まらせ、効率的な給餌を防ぐことができる長いセタエを所有することができるので、O.ディオイカの成長に潜在的に有害である49。我々は頻繁にC.カルシトランスセタエによって詰まっている小動物の家を観察しました。したがって、2日目以上の動物にのみC.カルシトランスを供給します(表3)。
ここでは問題ではありませんでしたが、O.dioicaの小規模な長期培養は、遺伝的ボトルネックのために人口規模の急激な低下を経験する可能性があります。このような場合、マルティ・ソランらは29世代ごとに新しい野生の個人を文化に加えることを推奨しています。
オイコプレラ文化システムは柔軟です。1週間以内に安定した文化を確立することができます。O.dioicaの長期培養は、非専門機器を備えた控えめな予算で可能です。オイコプレウラの5~10ビーカーのメンテナンスに必要な日々の労力は、一般的に2人で2時間未満です。O.ジオイカは、天然海水28にアクセスできない人に有益である人工海水で維持することもできる。藻類食品の長期保存は、固体培養および凍結保存29を使用して可能である。さらに、O.ジオイカ精子は凍結保存することができ、そして1年以上生存可能であり続ける50年。これらの要因はすべて、文化を容易に再確立できることを意味します。最後に、プレユーロブラキアspの偶発的な培養での過去の経験.オイコプレウラのために開発された培養システムは、潜在的に脆弱な遠洋生物のより広範なコミュニティに拡張することができることを示唆している可能性があります。
O.dioicaは、様々な生物学的分野に対する強力な洞察を提供し続けています。地域の季節性、細心の文化システム、そして少数の献身的な個人を理解することで、効果的な文化をほとんど努力して確立することができます。オイコプレウラ培養システムは、このユニークな海洋帯腺の生態学、開発、ゲノミクス、および進化に関する幅広い生物分野を調査するための基礎資源を提供します。
The authors have nothing to disclose.
ガース・イルズリーが文化システムの確立を支援してくれたことに感謝しています。我々は、須山律子とシルヴァン・ギロの早期サンプリングと種同定の取り組みに対する貢献を認める。西田博樹、大沼武志、表胸達也さんの皆様には、地元の培養システムの初期設立や動物や微細文化の共有など、幅広いサポートと指導を受け、感謝の気持ちを抱いています。また、ダニエル・チュラウト、ジャン=マリー・ブーケ、アン・アースヨルド、クリスティアン・カニェストロ、アルフォンソ・フェランデス=ロルダンのサンプリングと培養に関する専門知識を共有してくれたことに感謝します。ジャイ・デントン、チャールズ・プレッシー、ジェフリー・ジョリーは原稿に貴重なフィードバックを提供しました。シャーロット・ウェストは藻類計算のための一般化された方程式を策定した。最後に、OISTの資金、メアリー・コリンズ、OISTフィールドワーク安全委員会に対し、安全なサンプリング手順に関するアドバイス、培養・サンプリング装置の建設に関するOIST機械店のスタッフ、海水を供給してくれた藤田浩一に感謝します。
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |