Oikopleura二恶英是生物学各个领域的一种特长模型有机体。我们描述了动物和藻类饲料的取样方法、物种鉴定、培养设置和养殖方案。我们强调有助于加强文化体系的关键因素,并讨论可能出现的问题和解决办法。
Oikopleura二恶英是具有卓越的过滤喂养能力、快速生成时间、保存早期发育和紧凑的基因组的木板和弦剂。由于这些原因,它被认为是海洋生态学研究、进化发育生物学和基因组学的有用模型有机体。由于研究往往需要稳定的动物资源供应,因此建立可靠、低维护的培养系统是很有用的。在这里,我们描述了建立O. 二恶英文化的分步方法。我们描述了如何选择潜在的采样地点、收集方法、目标动物鉴定以及培养系统的设置。我们根据自己的经验提供故障排除建议。我们还强调有助于维持强大文化体系的关键因素。虽然这里提供的文化协议是针对O.二恶英的,但我们希望我们的采样技术和文化设置将激发维护其他脆弱的中上层无脊椎动物的新想法。
模型生物在解决许多生物学问题方面发挥了重要作用,包括与发育、遗传学和生理学有关的问题。此外,额外的模型生物促进新的发现,因此是至关重要的,以更好地了解自然11,2。2海洋浮游动物是多种多样的生物群,在海洋生态系统3、4、5、64,5,6中起着重要作用。3尽管转基因生物,如浮游生物,其多样性研究往往代表性不足,因为它们的透明度和脆弱性使得实地收集和鉴定具有挑战性。,8经过改造的取样技术和实验室培养,可以更密切地观察体外动物,从而进一步推动了浮游生物99、10、11、1210,11,12的生物学知识。
拉瓦奇安人(附属动物)是一类自由游泳的海洋服,包括约70个描述物种,全世界8,8,13。由于幼鸟是浮游动物群落中最丰富的群体之一,14、15、16、17,幼虫是大型浮游生物的主要食物来源,如鱼幼虫14,15,16,1718、19。,19不像阿西德人-塞西利亚的长袍-拉瓦奇人保留一个类似小孔的形态,并在整个20年保持木板。每只动物都生活在一个自建的、复杂的过滤喂养结构内,称为房屋。他们通过尾巴的起伏运动产生水流来积累房屋中的颗粒物。被堵塞的房屋整天被丢弃,其中一些形成碳聚集物,最终沉入海底22;因此,拉瓦奇人在全球碳通量23中扮演着重要角色。据报道,大多数物种生活在水柱13的上100米内的中上层区域;然而,巨大的拉瓦坦巴托乔达乌斯是已知的居住在300米24的深度。加州蒙特利湾的巴索科达乌斯研究显示,这些动物也是微塑料的生物载体,这表明在了解附属动物在海洋中微塑料垂直运输和分布中的作用方面具有潜在的重要性。
由于几个显著的特点,小子拉二恶英是一种幼虫,近年来作为模范有机体引起了人们的注意。它通常报告在世界各地的海洋。它在沿海水域特别丰富26,这很容易从岸边取样。长期,稳定的养殖是可能的与天然和人工海水27,28,29。28,2927在实验室条件下,温度依赖生成时间短至4-9天。它具有很高的肥力,每个女性都能全年生产>300个鸡蛋。作为一种调谐,它占据着理解和弦进化30,31,31的重要遗传位置。在70Mb,O.迪奥尼卡在所有和弦32中拥有最小的识别基因组。在幼虫中,O. 二恶英是迄今为止唯一被描述的非赫马普罗蒂物种。
帕芬霍夫34报道了第一个成功与实验室生长的微藻的O.二恶英养殖。使用同步电机和桨的原始培养协议由 Fenaux 和 Gorsky35开发,后来被多个实验室采用。最近,Fujii等人36日报告了人工海水中的O.二恶英栽培、强大的养殖系统和田间采集,由Bouquet等人27日报道,对简化、经济实惠的系统进行了优化的规程。除了传统的Oikopleura文化系统外,新报道的带有双管饲养罐的设计也具有培养Oikopleura sp.的潜力。37.
我们提出了一个详细的协议,以Sars国际海洋分子生物学中心27号、巴塞罗那大学29号、大阪大学28号主要奥科普莱拉研究小组开发的协议以及我们自己的观测结果为基础,启动O.二元单一栽培。在以前公布的文化协议中,仅粗略地描述了有关藻媒组成、海岸采样技术和Oikopleura识别的详细信息,留下了许多模糊性。在这里,借助视频协议中的视觉信息,我们以直接、分步的方式从一个简单、分步的方式从开始建立O. dioica文化所需的所有关键信息。我们描述了如何区分O.dioica与另一个常见的物种,O. longicauda,这是最具挑战性的步骤之一。虽然现有的文化系统适用于全球种植O. 二恶英,但我们强调根据当地环境条件进行协议调整的重要性。所提交的信息结合了广泛发布的数据以及通过经验获得的知识。目前的协议非常适合有兴趣从头开始建立文化的研究人员。
为了便于在建立O.二恶英文化中的灵活性,了解动物的自然栖息地是很重要的。季节性数据提供有关物理参数范围的信息,可用于指导实验室的培养条件。它还有助于理解动物数量丰富的季节性波动。在冲绳,O. dioica最可靠地发现从6月到10月。然而,在东京湾,人口高峰在2月和10月41日。虽然O.dioica的培养经常在20°C或更低27°C或更低27,28,29,28,29冲绳O.二恶英显示更好的生存温度超过20°C;27这可以解释为冲绳的最低地表海水温度为+20°C(图6)。O. 二恶英的丰度也可能受到浮游植物盛开42和捕食者丰度43,44,44的影响。无论在何处收集O. dioica,了解当地人口的季节性,都最大限度地利用取样和培养成功的机会。
鉴于适当的季节和位置,净采样是收集大量Oikopleura的有效方法,只需付出最少的努力。网状尺寸较小的浮游生物网(60-70 μm)也可用于收集动物的所有阶段。完全成熟的动物很少在网中被发现,也许是因为它们在生命周期结束时很脆弱。因此,通过对亚弦细胞的微观观察,对物种进行鉴定,然后进行取样。成熟个体通常在取样后出现一两天,因为动物在实验室里继续生长。虽然净抽样是有效的,但在不同情况下可能需要采用替代采样方法。例如,城区附近的净采样可以收集大量的浮游植物,因此很难分离Oikopleura。在这种情况下,建议从港口以外地区收集表面海水或船只取样的简单桶式取样。结果表明,连续几天降雨导致盐度的逐渐变化,不影响奥二恶英的丰度;但是,在极端天气事件(如热带气旋)之后,应避免立即进行岸上取样。这些事件导致突然和剧烈的生物地球化学变化在庇护水体45,46。45,雨水径流可能携带污染物、沉积物和过量的营养物质,增加浊度和水质下降47。过滤器喂养浮游生物,如Oikoplea,可能特别容易受到这些变化的影响,因为他们的喂养方式和有限的流动性。在这种情况下,我们建议将采样推迟几天,直到当地情况恢复正常。
引入多步过滤系统对于维持小的过滤喂养生物(如O.二恶英)至关重要。使用过滤不良的海水(例如,以前培养系统中的25μm网状物),培养通常不稳定,特别是在夏季,这可能是由于浮游植物的丰度较高。虽然一些浮游植物有利于O.二甲体的生长,但其他产生生物毒素,可能导致O.二甲胚胎的异常发育48。此外,高浓度的硅藻,如柴托切罗斯spp.有可能有害O.二恶英的生长,因为他们可以拥有长集,可以堵塞房子,防止有效的喂养49。我们经常观察到小动物的房屋被C.钙化物塞塔堵塞;因此,我们现在只在第2天和更年纪的动物饲料(表3)。
虽然这里不是问题,但由于遗传瓶颈,小规模长期栽培O.dioica可能经历人口规模的突然下降;在这种情况下,Marté-Solans等人29日建议每20代在文化中增加新的野生个体。
欧高浦文化系统是灵活的。稳定的文化可以在一周内建立。长期培养O.dioica是有可能在有限的预算与非专业设备。维修5-10个小焦树的每日工作通常少于2小时,Oikopleura有2人。O. 二恶英也可以保存在人工海水中,这对没有天然海水的人有益。长期储存藻类食物,可以使用固体培养和冷冻保存29。此外,O. 二恶英精子可以冷冻保存,并保持活超过50年。所有这些因素都意味着文化很容易重新建立。最后,过去的经验与普鲁拉布拉基亚斯普的意外培养。可能暗示为Oikopleura开发的培养系统有可能扩展到更广泛的脆弱的中上层生物群落。
O. 迪奥尼卡继续为各种生物领域提供强有力的见解。对当地季节性的理解、细致的文化体系以及一些敬业的个人,使得有效的文化得以毫不费力地建立起来。Oikopleura培养系统为研究与生态、发育、基因组学和进化这一独特的海洋弦弦酶相关的广泛生物领域提供了基线资源。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢加思·伊尔斯利对建立文化体系的支持。我们感谢苏山和西尔万·吉洛特在早期取样和物种鉴定方面的贡献。特别感谢西田弘子、小野平和大田洋子的慷慨支持和指导,包括初步建立当地的养殖系统,分享动物和微藻文化。我们还感谢丹尼尔·乔鲁特、让-玛丽·布凯、安妮·阿索德、克里斯蒂安·卡埃斯特罗和阿方索·费伦德斯-罗登分享他们在取样和培养方面的专长。杰·丹顿、查尔斯·普莱西和杰弗里·乔利对手稿提供了宝贵的反馈。夏洛特·韦斯特为藻类计算制定了一个通用方程。最后,我们感谢OIST的资助,玛丽·柯林斯和OIST现场工作安全委员会就安全取样程序提供建议,OIST机器车间的工作人员为建造养殖和取样设备,以及小池东田提供海水。
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |