L’oikopleura dioica è un organismo modello di tunicato in vari campi della biologia. Descriviamo i metodi di campionamento, l’identificazione delle specie, l’impostazione della coltura e i protocolli di coltura per gli animali e i mangimi algali. Mettiamo in evidenza i fattori chiave che hanno contribuito a rafforzare il sistema culturale e a discutere i possibili problemi e risoluzioni.
Oikopleura dioica è un accordo planctonico con eccezionale capacità di filtraggio, tempo di generazione rapido, prestato sviluppo precoce, e un genoma compatto. Per questi motivi, è considerato un organismo modello utile per gli studi ecologici marini, la biologia evolutiva dello sviluppo e la genomica. Poiché la ricerca spesso richiede una fornitura costante di risorse animali, è utile stabilire un sistema di coltura affidabile e a bassa manutenzione. Qui descriviamo un metodo passo-passo per stabilire una cultura O. dioica. Descriviamo come selezionare potenziali siti di campionamento, metodi di raccolta, identificazione animale di destinazione e la configurazione del sistema di coltura. Forniamo consigli per la risoluzione dei problemi in base alle nostre esperienze. Mettiamo in evidenza anche i fattori critici che aiutano a sostenere un sistema di coltura robusto. Anche se il protocollo culturale fornito qui è ottimizzato per O. dioica, speriamo che la nostra tecnica di campionamento e la configurazione della cultura ispireranno nuove idee per mantenere altri fragili invertebrati pelagici.
Gli organismi modello sono stati fondamentali nell’affrontare molte questioni biologiche, tra cui quelle relative allo sviluppo, alla genetica e alla fisiologia. Inoltre, ulteriori organismi modello facilitano nuove scoperte e sono quindi cruciali per ottenere una maggiore comprensione della natura1,2. Lo zooplancton marino sono diversi gruppi di organismi che svolgono un ruolo importante negli ecosistemi oceanici3,4,5,6. Nonostante la loro abbondanza e l’importanza ecologica, gli organismi gelatinosi come i tunicati planctoni sono spesso sottorappresentati negli studi sulla biodiversità del plancton perché la loro trasparenza e fragilità rendono la raccolta e l’identificazione dei campi impegnativida 7,8. Tecniche di campionamento adattate e colture di laboratorio permettono una più stretta osservazione degli animali in vitro, che ha ulteriormente intensificato le conoscenze nella biologia dei tunicati planctonici9,10,11,12.
Larvacei (Appendicolari) sono una classe di tunicati marini che comprendono circa 70 specie descritte in tutto il mondo8,13. Poiché sono uno dei gruppi più abbondanti all’interno delle comunità di zooplancton14,15,16,17,larvacei rappresentano una fonte primaria di cibo per organismi planctonici più grandi come le larve di pesce18,19. A differenza degli ascidiani – i tunicati sessili-larvacei mantengono una morfologia girino-come e rimangono planctonici per tutta la vita20. Ogni animale vive all’interno di una struttura auto-costruita e intricata per l’alimentazione dei filtri conosciuta come casa. Accumulano particolato nelle loro case creando correnti d’acqua attraverso il movimento ondulato delle loro code21. Le case intasate vengono scartate per tutto il giorno, alcune delle quali formano aggregati di carbonio e alla fine affondano al fondo marino22; così, i larvacei svolgono un ruolo importante nel flusso globale del carbonio23. La maggior parte delle specie sono segnalate per vivere nella zona pelagica entro i 100 m superiori della colonna d’acqua13; tuttavia, la larva gigante Bathochordaeus è noto per abitare le profondità di 300 m24. Uno studio su Bathochordaeus nella baia di Monterey, California ha rivelato che gli animali fungono anche da vettore biologico di microplastiche, suggerendo una potenziale importanza nella comprensione del ruolo degli appendicolari nel trasporto verticale e nella distribuzione di microplastiche negli oceani25.
Oikopleura dioica, una specie di larvaceica, ha attirato l’attenzione negli ultimi anni come organismo modello a causa di diverse caratteristiche notevoli. È comunemente riportato in tutti gli oceani del mondo. E ‘particolarmente abbondante nelle acque costiere26, che permette un facile campionamento dalla riva. La coltura stabile e a lungo termine è possibile con acqua di mare sia naturale che artificiale27,28,29. I tempi di generazione dipendenti dalla temperatura sono brevi fino a 4-9 giorni in condizioni di laboratorio. Ha un’alta fecondità con ogni femmina in grado di produrre >300 uova durante tutto l’anno. Come tunicato, occupa un’importante posizione filogenetica per comprendere l’evoluzione accordiate30,31. A 70 Mb, O. dioica ha il più piccolo genoma identificato tra tutti i chordates32. Tra i larvepati, O. dioica è l’unica specie non ermafrotica descritta finora33.
La prima coltura di O. dioica di successo con microalghe coltivate in laboratorio è stata riportata da Paffenh’fer34. Il protocollo originale della coltura con motori e pale sincroni è stato sviluppato da Fenaux e Gorsky35 e successivamente adottato da più laboratori. Più recentemente, Fujii et al.36 ha riferito o. dioica culturing in acqua di mare artificiale, un sistema di coltura robusto e la raccolta sul campo sono stati descritti da Bouquet et al.27 e un protocollo ottimizzato per un sistema semplificato e conveniente è stato segnalato da Marti-Solans et al.29. Oltre al tradizionale sistema di coltura Oikopleura, un design recentemente riportato con un serbatoio di allevamento a doppio tubo ha anche il potenziale per la coltura Oikopleura sp. 37.
Presentiamo un protocollo dettagliato per l’insorgere di una monocultura O. dioica basato su una combinazione di protocolli sviluppati dai principali gruppi di ricerca Oikopleura presso il Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, l’Università di Barcellona29, l’Università di Osaka28,e le nostre osservazioni. Nei protocolli culturali pubblicati in precedenza, informazioni dettagliate sulla composizione dei media algali, sulle tecniche di campionamento a terra e sull’identificazione di Oikopleura sono state descritte solo approssimativamente, lasciando molte ambiguità. Qui, con l’aiuto delle informazioni visive nel protocollo video, abbiamo raccolto tutte le informazioni critiche necessarie per creare una cultura O. dioica da zero in modo semplice e graduale. Descriviamo come distinguere O. dioica da un’altra specie comunemente riportata, O. longicauda, che è uno dei passi più impegnativi. Anche se i sistemi di coltura esistenti sono applicabili per la coltivazione di O. dioica in tutto il mondo, sottolineiamo l’importanza dell’adattamento del protocollo in base alle condizioni ambientali locali. Le informazioni presentate combinano dati ampiamente pubblicati e conoscenze acquisite attraverso l’esperienza. L’attuale protocollo è ideale per i ricercatori interessati a stabilire una cultura da zero.
Per facilitare la flessibilità nella creazione della cultura O. dioica, è importante comprendere l’habitat naturale degli animali. I dati stagionali forniscono informazioni sulle gamme di parametri fisici, che possono essere utilizzate per guidare le condizioni di coltura di laboratorio. Aiuta anche a comprendere le fluttuazioni stagionali nell’abbondanza di animali. A Okinawa, O. dioica è più affidabile trovare da giugno a ottobre. Tuttavia, nella baia di Tokyo, le popolazioni picchiano in febbraio eottobre il 41. Anche se la coltura di O. dioica è spesso segnalata a 20 gradi centigradi o inferiore a27,28,29, Okinawan O. dioica mostra una migliore sopravvivenza a temperature superiori ai 20 gradi centigradi;29 questo potrebbe essere spiegato dal fatto che la temperatura minima delle acque di mare di superficie a Okinawa è di 20 gradi centigradi(Figura 6). L’abbondanza di O. dioica potrebbe anche essere influenzata dalle fioriture di fitoplancton42 e dall’abbondanza di predatori43,44. Indipendentemente da dove vengono raccolti O. dioica, comprendere la stagionalità delle popolazioni locali massimizza la possibilità di campionamento e di coltura del successo.
Data la stagione e la posizione appropriate, il campionamento netto è un modo efficace per raccogliere un gran numero di Oikopleura con il minimo sforzo. Le reti a cretolone con una dimensione di rete più piccola (60-70 m) possono anche essere utilizzate per raccogliere tutte le fasi degli animali. Gli animali completamente maturi si trovano raramente in rete, forse a causa della loro fragilità alla fine del ciclo di vita. Pertanto, l’identificazione delle specie seguite dal campionamento è ottenuta dall’osservazione microscopica delle cellule sottocordali. Gli individui maturi di solito appaiono uno o due giorni dopo il campionamento mentre gli animali continuano a crescere in laboratorio. Sebbene il campionamento netto sia efficiente, in circostanze diverse potrebbero essere necessari metodi di campionamento alternativi. Ad esempio, il campionamento netto vicino alle aree urbane può raccogliere un gran numero di fitoplancton, rendendo difficile isolare l’Oikopleura. In questi casi, si raccomanda un semplice campionamento di benne per raccogliere l’acqua di mare o il campionamento in barca da aree oltre il porto. I risultati hanno mostrato che il graduale cambiamento di salinità dovuto a giorni consecutivi di pioggia non ha influenzato l’abbondanza di O. dioica; tuttavia, il campionamento a terra subito dopo eventi meteorologici estremi come i cicloni tropicali dovrebbe essere evitato. Questi eventi causano improvvisi e drastici cambiamenti biogeochimici in un corpo riparato di acqua45,46. Il deflusso delle acque piovane può trasportare inquinanti, sedimenti e sostanze nutritive in eccesso, che aumentano la torbidità e la qualità dell’acquainferiore 47. Il plancton per l’alimentazione dei filtri, come l’Oikopleura,può essere particolarmente suscettibile a questi cambiamenti a causa della loro modalità di alimentazione e della mobilità limitata. In tali circostanze, si consiglia di posticipare il campionamento per alcuni giorni fino a quando le condizioni locali tornano alla normalità.
L’introduzione di un sistema di filtro multifase è essenziale per mantenere piccoli organismi che alimentano filtri come O. dioica. Utilizzando acqua di mare scarsamente filtrata (ad esempio, una maglie da 25 m nel sistema di coltura precedente), la coltura era spesso instabile soprattutto durante l’estate, potenzialmente a causa della maggiore abbondanza di fitoplancton. Anche se alcuni fitoplancton sono benefici per la crescita diOica, altri producono biotossine che possono causare lo sviluppo anomalo di embrioni O. dioica 48. Inoltre, un’alta concentrazione di diatomee come Chaetoceros spp. sono potenzialmente dannose per la crescita di O. dioica in quanto possono possedere lunghe setae che possono intasare la casa e prevenire un’alimentazione efficiente49. Spesso osservavamo case di piccoli animali intasati da C. calcitrans setae; quindi, ora diamo da mangiare C. calcitrans solo agli animali al giorno 2 e più anziani (Tabella 3).
Anche se non era un problema qui, la coltura a lungo termine su piccola scala di O. dioica può sperimentare improvvisi cali di dimensione della popolazione a causa di un collo di bottiglia genetico; in questi casi, Marta-Solans et al.29 consiglia di aggiungere nuovi individui selvatici alla cultura ogni 20 generazioni.
Il sistema di coltura Oikopleura è flessibile. Una cultura stabile può essere stabilita entro una settimana. La coltura a lungo termine di O. dioica è possibile con un budget modesto con attrezzature non specialistiche. Lo sforzo quotidiano richiesto per la manutenzione di 5-10 becher di Oikopleura è generalmente meno di 2 ore con 2 persone. O. dioica può essere mantenuta anche in acqua di mare artificiale, che è vantaggioso per coloro che non hanno accesso all’acqua di mare naturale28. Lo stoccaggio a lungo termine di alimenti algali è possibile utilizzando la cultura solida e la crioconservazione29. Inoltre, lo sperma O. dioica può essere crioconservato e rimanere vitale per più di un anno50. Tutti questi fattori significano che le culture possono essere facilmente ristabilite. Infine, esperienza passata con la coltura accidentale di Pleurobrachia sp. può suggerire che il sistema di coltura sviluppato per Oikopleura potrebbe potenzialmente essere esteso a una più ampia comunità di fragili organismi pelagici.
O. dioica continua a fornire potenti approfondimenti su vari campi biologici. La comprensione della stagionalità locale, un sistema culturale meticoloso e alcuni individui dedicati permettono di stabilire una cultura efficace con poco sforzo. Il sistema di coltura di Oikopleura fornisce le risorse di base per studiare una vasta gamma di campi biologici relativi all’ecologia, allo sviluppo, alla genomica e all’evoluzione di questo unico accordo marino.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a Garth Ilsley per il suo sostegno nella creazione del sistema culturale. Riconosciamo il contributo di Ritsuko Suyama e Sylvain Guillot al campionamento precoce e agli sforzi di identificazione delle specie. Un ringraziamento speciale è grazie a Hiroki Nishida, Takeshi Onuma e Tatsuya Omotezako per il loro generoso sostegno e guida in tutto, tra cui l’istituzione iniziale del sistema di coltura locale e la condivisione di animali e cultura microalgal. Ringraziamo anche Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Caestro e Alfonso Ferràndez-Roldàn per aver condiviso le loro competenze nel campionare e coltivare. Jai Denton, Charles Plessy e Jeffrey Jolly fornirono un feedback prezioso sul manoscritto. Charlotte West ha formulato un’equazione generalizzata per il calcolo delle alghe. Infine, ringraziamo OIST per il finanziamento, Mary Collins e il Comitato per la sicurezza sul lavoro sul campo OIST per la consulenza sulle procedure di campionamento sicuro, il personale del negozio di macchine OIST per la costruzione di attrezzature di coltura e campionamento e Koichi Toda per la fornitura di acqua di mare.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |