Summary

Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem

Published: June 03, 2020
doi:

Summary

Mikropsuz Napa lahanaları yetiştirme yöntemi, araştırmacıların tek mikrobiyal türlerin veya çok türlü mikrobiyal toplulukların lahana yaprağı yüzeylerinde nasıl etkileşimde bulunduklarını değerlendirmelerini sağlar. Steril bir sebze özü de sebze fermantasyon sırasında toplum kompozisyon vardiya ölçmek için kullanılabilir sunulmaktadır.

Abstract

Filosfer, mikroplar tarafından kolonize edilebilir bitkinin zemin üstü kısmı, mikrobiyal topluluk montaj süreçlerini belirlemek için yararlı bir model sistemidir. Bu protokol, Napa lahana bitkilerinin fillosferindeki mikrobiyal topluluk dinamiklerini incelemek için bir sistem özetlemektedir. Bu bir kireçlenmiş kil ve besin suyu substrat ile test tüpleri mikropsuz bitkiler büyümek için nasıl açıklar. Mikrobuzsuz bitkilerin belirli mikrobiyal kültürlerle aşılanması, fillosferdeki mikrobiyal büyümeyi ve toplum dinamiklerini ölçmek için fırsatlar sağlar. Fermantasyon sırasında oluşan mikrobiyal topluluklarda lahanalardan üretilen steril sebze ekstresinin kullanımı da değerlendirilebilir. Bu sistem nispeten basit ve ucuz laboratuvarda kurmak ve mikrobiyal topluluk montaj önemli ekolojik sorulara hitap etmek için kullanılabilir. Ayrıca, fillosfer topluluk bileşiminin mikrobiyal çeşitliliği ve sebze fermantasyonlarının kalitesini nasıl etkileyip etkilebildiğini anlamak için fırsatlar sunar. Gnotobiyotik lahana fillosfer topluluklarının geliştirilmesi için bu yaklaşım diğer yabani ve tarımsal bitki türlerine uygulanabilir.

Introduction

Fillosferin mikrobiyal çeşitliliği bitki sağlığının korunmasında önemli bir rol oynar ve aynı zamanda bitkilerin çevreselstresedayanma yeteneğini etkileyebilir 1,2,3,4,5. Buna karşılık, bitkilerin sağlığı doğrudan gıda güvenliği ve kalite6,7etkiler. Bitkiler ekosistem işleyişinde rol oynar lar ve bunlara bağlı mikrobiyomlar hem bitkilerin bu faaliyetleri yürütme yeteneğini etkiler hem de çevreyi doğrudan etkiler8. Bilim adamları phyllosphere fonksiyonu ve bileşimi deşifre etmeye başlamış olsa da, fillosfer mikrobiyal topluluk montaj etkileyen ekolojik süreçler tam olarak anlaşılamamıştır9,10. Fillosfer mikrobiyomu mikrobiyom11ekolojisini incelemek için mükemmel bir11deneysel sistemdir. Bu topluluklar nispeten basit ve topluluk üyelerinin çoğu standart laboratuvar medya10,12,,13yetiştirilebilir.

Fermente sebzeler, fillosferin toplum yapısının önemli sonuçları olduğu bir sistemdir. Hem lahana turşusu hem de kimchi’de, doğal olarak sebze yapraklarında (Brassica türlerinin fillosferi) oluşan mikroplar fermantasyon için inokül olarak hizmet vermektedir14,15. Laktik asit bakterileri (LAB) bitkisel mikrobiyomların her yerde üyeleri olarak kabul edilir, ancak onlar fillosfer de düşük bolluk olabilir16. Fermantasyon sırasında güçlü abiyotik seçimi, laktik asit bakterilerinin bolluğa artmasına olanak sağlayan mikrobiyal topluluk bileşiminde bir kaymaya yol açtır. LAB büyüdükçe, fermente bitkisel ürünlerin asidik ortamı nı oluşturan laktik asit üretirler17. Fillosfer ve fermantasyon arasındaki bağlantı mikrobiyomların nasıl yapılandırDığını anlamak için sebzeleri bir model olarak kullanma fırsatı sağlar.

Biz mikrop içermeyen Napa lahana büyümek ve sprey şişeleri kullanarak belirli mikrobiyal topluluklar ile aşılamak için yöntemler geliştirdik. Bu eşit ya bireysel mikroplar veya karışık topluluklar ile lahana aşılama ucuz ve güvenilir bir yöntemdir. Bir steril sebze özü (SVE) da üç farklı lahana türleri / çeşitleri geliştirilmiştir: kırmızı ve yeşil lahana(Brassica oleracea) ve Napa lahana(B. rapa). Bu SV’lere tuz ilavesi fermantasyon ortamını kopyalar ve fermantasyon mikrobiyom montajının küçük ölçekli ve nispeten yüksek iş lenmeli deneysel çalışmalarına olanak sağlar. Bu yöntemler, fillosferdeki mikrobiyal topluluk montajını ve fillosferdeki mikrobiyal topluluk dinamiğinin bitkisel fermantasyonun başarısıyla nasıl bağlantılı olabileceğini incelemek için kullanılabilir.

Protocol

1. Büyüyen mikropsuz lahanalar Mikropsuz lahana yetiştirmek için ekipman hazırlama İnce toz partiküllerini gidermek için kireçlenmiş kilin temizlenmesi Çalsamalı kil(Malzeme Tablosu)en az 3x musluk suyu ile durulayın; suyu boşaltın.DİkKAT: Kireçlenmiş kil çok ince toz üretir ve yıkanırken koruyucu bir maske(Malzeme Tablosu)takmaları tavsiye edilir. Sterilize etmek için ince bir tabaka (~4 cm) halinde ince bir tabaka halind…

Representative Results

Napa lahanabüyüme oranlarıTohum sterilizasyon yöntemi birkaç farklı Napa lahanası ile test edildi (B. rapa var pekinese; Ek Şekil 1) farklı tedarikçilerin bir dizi ve tüm benzer büyüme oranları ile tutarlı büyüdü. Ancak, Brassica farklı türleri ile yöntemleri test (B. rapa: Şalgam Mor Top; B. oleracea: Kahire Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Oyuncak Choy Hybrid; <em…

Discussion

Mikropsuz Napa lahana bitkileri Napa lahana phyllosphere17laktik asit bakterilerin dağılım sınırlaması incelemek için kullanılmıştır. Mikropsuz Napa lahanalar da fillosferde bireysel veya çift-bilge büyüme test etmek için kullanılabilir (Şekil 1). Kırmızı, yeşil ve Napa: steril sebze özü yapmak için yöntemler lahana üç farklı çeşitleri için test edilmiştir. Bu SVE’lerin her biri güvenilir bir büyüme ortamı olarak hareket eder; aşı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma USDA-NIFA hibesi ile desteklenmiştir: 2017-67013-26520. Tracy Debenport ve Claire Fogan teknik destek sağladı ve Ruby Ye ve Casey Cosetta bu el yazmasının erken sürümleri hakkında yararlı yorumlar sağlar.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 20170-650
15 mL conical tubes Falcon 352096
7-way tray tray Sigma Magenta T8654
Amber Round Boston Glass Bottle GPS 712OZSPPK12BR Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters If you care (unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free) Austin's 50-010-45
Borosilicate Glass tubes VWR 47729-586
Calcined clay Turface MVP Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender Cuisinart Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors 7-389-A American Educational Products Ordered on Amazon.com
Ethanol VWR 89125-172
Forceps Aven 18434 Ordered on Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
KleenGuard M10 Kimberley-Clark 64240
Large plastic container Rubbermaid Ordered on Amazon.com
Light racks Gardner's Supply 39-357 full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps Millipore Sigma C1934
Man, Rogosa, and Sharpe Fisher Scientific DF0881-17-5 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP
Micropestle Carolina 215828 Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth Millipore Sigma M5519 Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl Sigma Aldrich S9888
Napa cabbage seeds Johnny's Select Seeds 2814G B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Used to make agar plates
Phosphate buffer saline Fisher Scientific 50-842-941 Teknova
Plant tissue culture box Sigma Magenta GA-7
Serologial pipettes VWR 89130-900
Sterile dowel Puritan 10805-018 Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter Nalgene 974103
Tryptic soy agar Fisher Scientific DF0370-17-3 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips Rainin 17007102
Yeast, peptone and dextrose Fisher Scientific DF0428-17-5 This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

References

  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
  2. Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
  5. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  6. Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
  7. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
  8. Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
  9. Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
  10. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
  11. Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
  12. Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
  13. Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
  14. Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
  15. Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
  16. Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
  17. Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
  18. Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
  19. Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
  20. Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
  21. Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
  22. Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
  23. Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
  24. Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
  25. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  26. Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).

Play Video

Cite This Article
Miller, E. R., O’Mara Schwartz, J., Cox, G., Wolfe, B. E. A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation. J. Vis. Exp. (160), e61149, doi:10.3791/61149 (2020).

View Video