Гототобиотическая система для изучения микробиомной ассамблеи в phyllosphere и в растительной ферментации
Summary
Разработан метод выращивания капусты Напа без микробов, который позволяет исследователям оценить, как отдельные микробные виды или многовидовые микробные сообщества взаимодействуют на поверхности листьев капусты. Также представлен стерильный растительный экстракт, который может быть использован для измерения изменений в составе сообщества во время брожения овощей.
Abstract
Филлофера, надземная часть растения, которая может быть колонизирована микробами, является полезной модельной системой для определения процессов сборки микробов. В этом протоколе излагается система изучения динамики микробного сообщества в филосфере капустных растений Напа. Он описывает, как выращивать растения без микробов в пробирках с кальцинированной глиной и питательным бульоном субстрата. Прививка растений, свободных от микробов, с конкретными микробными культурами дает возможность измерить рост микробов и динамику сообщества в филосфере. С помощью стерильного растительного экстракта, произведенного из капусты сдвиги в микробных сообществ, которые происходят во время брожения также могут быть оценены. Эта система является относительно простой и недорогой для установки в лаборатории и может быть использован для решения ключевых экологических вопросов в микробной сборки сообщества. Он также предоставляет возможность понять, как состав сообщества phyllosphere может влиять на микробное разнообразие и качество растительных брожения. Такой подход к развитию gnotobiotic капусты филлосферных сообществ может быть применен к другим диким и сельскохозяйственным видам растений.
Introduction
Микробное разнообразие филосферы играет важную роль в поддержании здоровья растений, а также может влиять на способность растений выдерживать экологический стресс1,,2,,3,,4,,5. В свою очередь, здоровье сельскохозяйственных культур непосредственно влияет на безопасность пищевых продуктов и качество6,7. Растения играют определенную роль в функционировании экосистем и связанных с ними микробиомов как влияют на способность растений осуществлять эти мероприятия, а также непосредственно влияющих на окружающую среду себя8. В то время как ученые начали расшифровывать функцию и состав филосферы, экологические процессы, влияющие на сборку микробного сообщества phyllosphere, не до конца поняты9,,10. Микробиом phyllosphere является отличной экспериментальной системой для изучения экологии микробиомов11. Эти сообщества являются относительно простыми, и многие из членов сообщества могут быть выращены на стандартных лабораторных средств массовой информации10,12,13.
Ферментированные овощи являются одной из систем, где общинная структура иллюровой имеет важные последствия. В квашеной капусте и кимчи микробы, которые естественным образом встречаются на растительных листьях (филосфера видов Brassica) служит инокулумом для брожения14,,15. Бактерии молочной кислоты (LAB) считаются вездесущими членами растительных микробиомов, однако они могут быть в низком изобилии в филосфере16. Сильный абиотический отбор во время брожения приводит к сдвигу в составе микробных сообществ, что позволяет молочнокислым бактериям увеличиваться в изобилии. Как LAB расти, они производят молочную кислоту, которая создает кислой среде ферментированных растительных продуктов17. Связь между филосферой и брожением дает возможность использовать овощи в качестве модели для понимания структуры микробиомов.
Мы разработали методы выращивания капусты Napa без микробов и прививать их конкретными микробными сообществами с помощью спрей-бутылок. Это недорогой и надежный метод равномерной прививки капусты либо отдельными микробами, либо смешанными сообществами. Стерильный растительный экстракт (SVE) также был разработан из трех различных типов капусты / сортов: красная и зеленая капуста (Brassica oleracea) и капуста Напа (B. rapa). Добавление соли в эти СВЕ воспроизводит среду брожения и позволяет проводить мелкомасштабные и относительно высокопроизводительные экспериментальные исследования ферментации микробиомной сборки. Эти методы могут быть использованы для изучения микробной сборки сообщества в филосфере и как микробная динамика сообщества в филосфере может быть связана с успехом растительного брожения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Без зародышей напа капусты растения были использованы для изучения рассеивания ограничение молочнокислых бактерий в напа капуста phyllosphere17. Капуста Napa без микробов также может быть использована для проверки индивидуального или парного роста в филосфере(рисуно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Трейси Дебенпорт и Клэр Фоган оказали техническую поддержку, а Руби Е и Кейси Косетта дают полезные комментарии по ранним версиям этой рукописи.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
