Un sistema gnotobiotico per studiare l'assemblaggio del microbioma nella Phyllosphere e nella fermentazione vegetale
Summary
È stato sviluppato un metodo per coltivare cavoli Napa privi di germi che consente ai ricercatori di valutare come singole specie microbiche o comunità microbiche multispecie interagiscono sulle superfici delle foglie di cavolo. Viene inoltre presentato un estratto vegetale sterile che può essere utilizzato per misurare i cambiamenti nella composizione della comunità durante la fermentazione vegetale.
Abstract
La fillosfera, la parte sotterranea della pianta che può essere colonizzata dai microbi, è un utile sistema modello per identificare i processi di assemblaggio della comunità microbica. Questo protocollo delinea un sistema per studiare le dinamiche della comunità microbica nella filosfera delle piante di cavolo Napa. Descrive come coltivare piante prive di germi in provette con un substrato di brodo di argilla e nutrienti. L’inoculazione di piante prive di germi con colture microbiche specifiche offre l’opportunità di misurare la crescita microbica e le dinamiche della comunità nella fillosfera. Attraverso l’uso di estratto vegetale sterile prodotto da cavoli si sposta nelle comunità microbiche che si verificano durante la fermentazione può anche essere valutato. Questo sistema è relativamente semplice ed economico da configurare in laboratorio e può essere utilizzato per affrontare le principali questioni ecologiche nell’assemblaggio della comunità microbica. Fornisce inoltre l’opportunità di capire in che modo la composizione della comunità della fillosfera può influire sulla diversità microbica e sulla qualità delle fermentazioni vegetali. Questo approccio per lo sviluppo di comunità di filosfera gnotobiotica potrebbe essere applicato ad altre specie vegetali selvatiche e agricole.
Introduction
La diversità microbica della fillosfera svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute delle piante e può anche influenzare la capacità delle piante di resistere allo stress ambientale1,2,3,4,5. A sua volta, la salute delle colture influisce direttamente sulla sicurezza alimentare e sulla qualità6,7. Le piante svolgono un ruolo nel funzionamento dell’ecosistema e i microbiomi associati influenzano entrambi la capacità delle piante di svolgere queste attività, sia influenzando direttamente l’ambiente stesso8. Mentre gli scienziati hanno iniziato a decifrare la funzione e la composizione della fillosfera, i processi ecologici che influenzano l’assemblaggio della comunità microbica della fillosfera non sono pienamente compresi9,10. Il microbioma della fillosfera è un ottimo sistema sperimentale per studiare l’ecologia dei microbiomi11. Queste comunità sono relativamente semplici e molti dei membri della comunità possono essere coltivati susupportidi laboratorio standard 10,12,13.
Le verdure fermentate sono un sistema in cui la struttura comunitaria della fillosfera ha conseguenze importanti. Sia nei crauti che nei kimchi, i microbi che si verificano naturalmente sulle foglie vegetali (la filosfera delle specie di Ottone) servono come inoculum per la fermentazione14,15. I batteri dell’acido lattico (LAB) sono considerati membri onnipresenti di microbiomi vegetali, tuttavia possono essere in bassa abbondanza nella fillosfera16. Una forte selezione abiotica durante la fermentazione favorisce uno spostamento nella composizione della comunità microbica che consente ai batteri dell’acido lattico di aumentare in abbondanza. Man mano che LAB cresce, producono acido lattico che crea l’ambiente acido dei prodotti vegetali fermentati17. Il legame tra la fillosfera e il fermento offre l’opportunità di utilizzare le verdure come modello per capire come sono strutturati i microbiomi.
Abbiamo sviluppato metodi per coltivare cavoli Napa privi di germi e per inocularli con specifiche comunità microbiche utilizzando bottiglie spray. Questo è un metodo economico e affidabile per inoculare uniformemente il cavolo con microbi individuali o comunità miste. Un estratto vegetale sterile (SVE) è stato sviluppato anche da tre diversi tipi di cavolo/varietà: cavolo rosso e verde (Brassica oleracea) e cavolo Napa (B. rapa). L’aggiunta di sale a queste SVI replica l’ambiente di fermentazione e consente studi sperimentali su piccola scala e relativamente ad alto velocità possibile di assemblaggio del microbioma di fermentazione. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare l’assemblaggio della comunità microbica nella fillosfera e come le dinamiche della comunità microbica nella fillosfera possono essere collegate al successo della fermentazione vegetale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le piante di cavolo Napa prive di germi sono state utilizzate per studiare la limitazione della dispersione dei batteri dell’acido lattico nella fillosfera del cavolo di Napa17. I cavoli Napa privi di germi possono anche essere utilizzati per testare la crescita individuale o a coppie nella fillosfera (Figura 1). I metodi per la produzione di estratto vegetale sterile sono stati testati per tre diverse varietà di cavolo: rosso, verde e Napa. Ognuna di queste SVI agis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport e Claire Fogan hanno fornito supporto tecnico e Ruby Ye e Casey Cosetta hanno fornito utili commenti sulle prime versioni di questo manoscritto.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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