نظام Gnotobiotic لدراسة تجميع الميكروبيوم في Phyllosphere وفي تخمير الخضروات
Summary
تم تطوير طريقة لزراعة الكرنب النابا خالية من الجراثيم التي تمكن الباحثين من تقييم كيفية الأنواع الميكروبية واحدة أو المجتمعات الميكروبية متعددة الأنواع تتفاعل على أسطح أوراق الملفوف. كما يتم تقديم مستخلص خضار معقمة يمكن استخدامها لقياس التحولات في تكوين المجتمع أثناء تخمير الخضروات.
Abstract
الفيلوسفير، الجزء الأرضي أعلاه من النبات الذي يمكن استعماره بواسطة الميكروبات، هو نظام نموذج مفيد لتحديد عمليات التجميع المجتمعية الميكروبية. يحدد هذا البروتوكول نظامًا لدراسة ديناميكيات المجتمع الميكروبي في الغلاف الفيلوسفيري لنابا من مصانع الملفوف. وهو يصف كيفية زراعة النباتات الخالية من الجراثيم في أنابيب الاختبار مع الطين الكالسيد وركيزة مرق المغذيات. التلقيح من النباتات الخالية من الجراثيم مع الثقافات الميكروبية محددة توفر فرصا لقياس النمو الميكروبي وديناميات المجتمع في فيلوسفير. من خلال استخدام مستخلص الخضار العقيمة المنتجة من التحولات الكرنب في المجتمعات الميكروبية التي تحدث أثناء التخمير يمكن أيضا أن تقدر. هذا النظام بسيط نسبيا وغير مكلف لإنشاء في المختبر ويمكن استخدامها لمعالجة المسائل البيئية الرئيسية في تجميع المجتمع الميكروبي. كما أنه يوفر فرصاً لفهم كيف يمكن لتكوين المجتمع فيلوسفير أن يؤثر على التنوع الميكروبي وجودة تخمير الخضروات. ويمكن تطبيق هذا النهج لتطوير مجتمعات الكرنب الغنوتيك فيلوسفير على أنواع نباتية أخرى برية وزراعة.
Introduction
التنوع الميكروبي للphyllosphere يلعب دورا هاما في الحفاظ على صحة النبات ويمكن أن تؤثر أيضا على قدرة النباتات على تحمل الإجهاد البيئي1,2,3,4,5. بدورها، تؤثر صحة المحاصيل بشكل مباشر على سلامة الأغذية وجودة6،7. النباتات تلعب دورا في أداء النظام الإيكولوجي والميكروبيومات المرتبطة بها على حد سواء تؤثر على قدرة النباتات على تنفيذ هذه الأنشطة، فضلا عن التأثير المباشر على البيئة أنفسهم8. في حين أن العلماء قد بدأت فك وظيفة وتكوين الفيلوسفير، والعمليات الإيكولوجية التي تؤثر في المجتمع فيلوسفير الميكروبية المجتمع غير مفهومة تماما9،10. الميكروبيوم phyllosphere هو نظام تجريبي ممتاز لدراسة البيئة من الميكروبيوم11. هذه المجتمعات بسيطة نسبيا ويمكن أن تزرع العديد من أفراد المجتمع على وسائل الإعلام مختبر القياسية10،12،13.
الخضروات المخمرة هي نظام واحد حيث هيكل المجتمع من phyllosphere له عواقب هامة. في كل من sauerkraut والكيمتشي، الميكروبات التي تحدث بشكل طبيعي على أوراق الخضروات (فيلوسفير من أنواع براسيكا) بمثابة inoculum للتخمير14،15. تعتبر بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) أعضاء في كل مكان من الميكروبات النباتية ، ومع ذلك يمكن أن تكون في وفرة منخفضة في phyllosphere16. اختيار غير أحيائي قوي أثناء التخمير يدفع تحولا في تكوين المجتمع الميكروبي تمكين البكتيريا حمض اللبنيك لزيادة في وفرة. كما ينمو LAB، فإنها تنتج حمض اللاكتيك الذي يخلق البيئة الحمضية من المنتجات النباتية المخمرة17. توفر الصلة بين الفيلوسفير والتخمير فرصة لاستخدام الخضروات كنموذج لفهم كيفية هيكلة الميكروبيوم.
لقد طورنا أساليب لزراعة الكرنب نابا الخالي من الجراثيم وتطعيمها بمجتمعات ميكروبية محددة باستخدام زجاجات الرش. هذا هو وسيلة رخيصة وموثوق بها من تطعيم بالتساوي الملفوف مع الميكروبات الفردية أو المجتمعات المختلطة. كما تم تطوير مستخلص خضار معقمة (SVE) من ثلاثة أنواع مختلفة من الكرنب/ الأصناف: الملفوف الأحمر والأخضر(Brassica oleracea)والملفوف نابا(B. rapa). إضافة الملح إلى هذه SVEs يكرر بيئة التخمير ويسمح للدراسات التجريبية على نطاق صغير وعالية الإنتاجية نسبيا من تجميع ميكروبيوم التخمير. ويمكن استخدام هذه الطرق لدراسة تجميع المجتمعات الميكروبية في الفيلوسفير وكيف يمكن ربط ديناميات المجتمع الميكروبي في الفيلوسفير بنجاح تخمير الخضروات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت النباتات الملفوف نابا خالية من الجراثيم لدراسة الحد من تشتت البكتيريا حمض اللاكتيك في فيلوسفير نابا الملفوف17. ويمكن أيضا أن تستخدم الجرثومة خالية من الملفوف نابا لاختبار الفرد أو الزوج من الحكمة النمو في phyllosphere(الشكل 1). وقد تم اختبار أساليب صنع مس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة وزارة الزراعة الأميركية-NIFA: 2017-67013-26520. قدمت تريسي ديبنبورت وكلير فوغان الدعم الفني، وقدمت روبي يي وكسي كوزيتا تعليقات مفيدة على النسخ المبكرة من هذه المخطوطة.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
