Een gnotobiotisch systeem voor het bestuderen van microbioomassemblage in de Phyllosfeer en in plantaardige fermentatie
Summary
Er is een methode ontwikkeld om kiemvrije Napakool te kweken, waarmee onderzoekers kunnen evalueren hoe enkele microbiële soorten of microbiële gemeenschappen op elkaar inwerken op koolbladoppervlakken. Er wordt ook een steriel groenteextract gepresenteerd dat kan worden gebruikt om verschuivingen in de samenstelling van de gemeenschap te meten tijdens de plantaardige gisting.
Abstract
De phyllosfeer, het bovengrondse gedeelte van de plant dat kan worden gekoloniseerd door microben, is een nuttig modelsysteem om processen van microbiële gemeenschapsassemblage te identificeren. Dit protocol schetst een systeem voor het bestuderen van microbiële gemeenschapsdynamiek in de phyllosfeer van Napa koolplanten. Het beschrijft hoe kiemvrije planten groeien in reageerbuizen met een gecalcineerde klei en voedingsbouillon substraat. Inenting van kiemvrije planten met specifieke microbiële culturen biedt mogelijkheden om microbiële groei en gemeenschapsdynamiek in de phyllosfeer te meten. Door het gebruik van steriel plantaardig extract geproduceerd uit koolverschuivingen in microbiële gemeenschappen die optreden tijdens de fermentatie kan ook worden beoordeeld. Dit systeem is relatief eenvoudig en goedkoop op te zetten in het lab en kan worden gebruikt om belangrijke ecologische vragen in microbiële gemeenschap assemblage aan te pakken. Het biedt ook mogelijkheden om te begrijpen hoe phyllosphere gemeenschap samenstelling kan invloed hebben op de microbiële diversiteit en de kwaliteit van plantaardige fermentaties. Deze aanpak voor de ontwikkeling van gnotobiotische kool phyllosphere gemeenschappen zou kunnen worden toegepast op andere wilde en agrarische plantensoorten.
Introduction
Microbiële diversiteit van de phyllosfeer speelt een belangrijke rol bij het behoud van de gezondheid van planten en kan ook invloed hebben op het vermogen van planten om milieustress te weerstaan1,2,3,4,5. De gezondheid van gewassen heeft op zijn beurt een directe invloed op de voedselveiligheid en -kwaliteit6,7. Planten spelen een rol in het functioneren van ecosystemen en de bijbehorende microbiomen hebben beide invloed op het vermogen van planten om deze activiteiten uit te voeren als het milieu zelf rechtstreeks te beïnvloeden8. Terwijl wetenschappers zijn begonnen met het ontcijferen van de functie en samenstelling van de phyllosfeer, de ecologische processen die invloed phyllosphere microbiële gemeenschap assemblage zijn niet volledig begrepen9,10. Het phyllosphere microbioom is een uitstekend experimenteel systeem voor het bestuderen van de ecologie van microbiomen11. Deze gemeenschappen zijn relatief eenvoudig en veel van de leden van de gemeenschap kunnen worden gekweekt op standaard lab media10,,12,13.
Gefermenteerde groenten zijn een systeem waarbij de gemeenschapsstructuur van de phyllosfeer belangrijke gevolgen heeft. In zowel zuurkool als kimchi dienen de microben die van nature voorkomen op groentebladeren (de fylosfeer van Brassica-soorten) als entmateriaal voor fermentatie14,15. Melkzuurbacteriën (LAB) worden beschouwd als alomtegenwoordige leden van plantaardige microbiomen, maar ze kunnen in lage overvloed in de phyllosfeer16. Sterke abiotische selectie tijdens fermentatie drijft een verschuiving in microbiële gemeenschapssamenstelling waardoor melkzuurbacteriën in overvloed kunnen toenemen. Als LAB groeien, produceren ze melkzuur dat de zure omgeving van gefermenteerde plantaardige productencreëert 17. Het verband tussen de phyllosfeer en de fermentatie biedt de mogelijkheid om groenten als model te gebruiken om te begrijpen hoe microbiomen zijn gestructureerd.
We hebben methoden ontwikkeld om kiemvrije Napa kool te kweken en in te enten met specifieke microbiële gemeenschappen met behulp van spuitflessen. Dit is een goedkope en betrouwbare methode om de kool gelijkmatig te inenten met individuele microben of gemengde gemeenschappen. Een steriel groenteextract (SVE) is ook ontwikkeld uit drie verschillende koolsoorten/variëteiten: rode en groene kool(Brassica oleracea) en Napa kool(B. rapa). De toevoeging van zout aan deze SV’s repliceert de fermentatieomgeving en maakt kleinschalige en relatief hoge doorvoer experimentele studies van fermentatiemicrobioomassemblage mogelijk. Deze methoden kunnen worden gebruikt om microbiële gemeenschapsassemblage in de phyllosfeer te bestuderen en hoe microbiële gemeenschapsdynamiek in de phyllosfeer kan worden gekoppeld aan het succes van plantaardige fermentatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kiemvrije Napa koolplanten zijn gebruikt om verspreidingsbeperking van melkzuurbacteriën in de Napa koolphyllosfeer17te bestuderen. Kiemvrije Napakool kan ook worden gebruikt om individuele of paarsgroei in de phyllosfeer te testen (figuur 1). Methoden voor het maken van steriel groenteextract zijn getest op drie verschillende soorten kool: rood, groen en Napa. Elk van deze SVE’s fungeren als een betrouwbare groei media; ingeënte microben groeien consistent over de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de USDA-NIFA subsidie: 2017-67013-26520. Tracy Debenport en Claire Fogan boden technische ondersteuning en Ruby Ye en Casey Cosetta geven nuttige opmerkingen over de vroege versies van dit manuscript.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
