Summary

Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation

Published: June 03, 2020
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Summary

Es wurde eine Methode entwickelt, keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen, die es Forschern ermöglicht, zu bewerten, wie einzelne mikrobielle Arten oder mikrobielle Gemeinschaften mit mehreren Arten auf Kohlblattoberflächen interagieren. Es wird auch ein steriler Pflanzenextrakt präsentiert, der zur Messung von Verschiebungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft während der Gemüsegärung verwendet werden kann.

Abstract

Die Phyllosphäre, der oberirdische Teil der Pflanze, der von Mikroben besiedelt werden kann, ist ein nützliches Modellsystem, um Prozesse der mikrobiellen Gemeinschaftsmontage zu identifizieren. Dieses Protokoll skizziert ein System zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre von Napa-Kohlpflanzen. Es beschreibt, wie keimfreie Pflanzen in Reagenzgläsern mit einem kalzinierten Ton- und Nährboden anwachsen. Die Impfung von keimfreien Pflanzen mit spezifischen mikrobiellen Kulturen bietet Möglichkeiten, das mikrobielle Wachstum und die Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre zu messen. Durch die Verwendung von sterilem Pflanzenextrakt aus Kohl können auch Verschiebungen in mikrobiellen Gemeinschaften, die während der Fermentation auftreten, bewertet werden. Dieses System ist relativ einfach und kostengünstig im Labor einzurichten und kann verwendet werden, um wichtige ökologische Fragen in der mikrobiellen Gemeinschaftsversammlung zu behandeln. Es bietet auch Möglichkeiten zu verstehen, wie die Zusammensetzung der Phyllosphärengemeinschaft die mikrobielle Vielfalt und Qualität der pflanzlichen Fermentationen beeinflussen kann. Dieser Ansatz zur Entwicklung von gnotobiotischen Kohlphyllosphärengemeinschaften könnte auf andere wilde und landwirtschaftliche Pflanzenarten angewendet werden.

Introduction

Die mikrobielle Vielfalt der Phyllosphäre spielt eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Pflanzengesundheit und kann auch die Fähigkeit von Pflanzen beeinflussen, Umweltbelastungen zu widerstehen1,2,3,4,5. Die Gesundheit der Kulturen wiederum wirkt sich direkt auf die Lebensmittelsicherheit und die Qualität6,7aus. Pflanzen spielen eine Rolle bei der Funktionsweise des Ökosystems und die damit verbundenen Mikrobiome beeinflussen sowohl die Fähigkeit der Pflanzen, diese Aktivitäten durchzuführen, als auch die Umwelt selbst direkt zu beeinflussen8. Während Wissenschaftler begonnen haben, die Funktion und Zusammensetzung der Phyllosphäre zu entschlüsseln, werden die ökologischen Prozesse, die die mikrobielle Gemeinschaft der Phyllosphäre beeinflussen, nicht vollständig verstanden9,10. Das Phyllosphärenmikrobiom ist ein ausgezeichnetes experimentelles System zur Erforschung der Ökologie von Mikrobiomen11. Diese Communities sind relativ einfach und viele der Community-Mitglieder können auf Standard-Labormedien10,12,13angebaut werden.

Fermentiertes Gemüse ist ein System, bei dem die Gemeinschaftsstruktur der Phyllosphäre wichtige Folgen hat. Sowohl im Sauerkraut als auch in der Kimchi dienen die Mikroben, die natürlicherweise auf gemüseblättern (der Phyllosphäre der Brassica-Arten) vorkommen, als Inokulum für die Fermentation14,15. Milchsäurebakterien (LAB) gelten als allgegenwärtige Mitglieder pflanzlicher Mikrobiome, können aber in der Phyllosphäre16in geringem Überfluss vorhanden sein. Starke abiotische Selektion während der Fermentation treibt eine Verschiebung der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung, die es Milchsäurebakterien ermöglicht, in Hülle und Fülle zu zunehmen. Während LAB wächst, produzieren sie Milchsäure, die die saure Umgebung von fermentierten pflanzlichen Produkten17 schafft. Die Verbindung zwischen phyllosphere und ferment bietet die Möglichkeit, Gemüse als Modell zu verwenden, um zu verstehen, wie Mikrobiome strukturiert sind.

Wir haben Methoden entwickelt, um keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen und sie mit speziellen mikrobiellen Gemeinschaften mit Sprühflaschen zu impfen. Dies ist eine kostengünstige und zuverlässige Methode, um den Kohl gleichmäßig mit einzelnen Mikroben oder gemischten Gemeinschaften zu impfen. Ein steriler Gemüseextrakt (SVE) wurde auch aus drei verschiedenen Kohlsorten/Sorten entwickelt: Rot- und Grünkohl (Brassica oleracea) und Napa Kohl (B. rapa). Die Zugabe von Salz zu diesen SVEs repliziert die Fermentationsumgebung und ermöglicht kleine und relativ hochdurchsatzige experimentelle Studien der Fermentationsmikrobiom-Montage. Diese Methoden können verwendet werden, um die mikrobielle Gemeinschaftsmontage in der Phyllosphäre zu untersuchen und wie die mikrobielle Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre mit dem Erfolg der pflanzlichen Fermentation in Verbindung gebracht werden kann.

Protocol

1. Keimfreie Kohlsorten anbauen Vorbereitungsgeräte für den Anbau von keimfreiem Kohl Reinigung des kalzinierten Tons zur Entfernung von Feinstaubpartikeln Kalzinierten Ton(Materialtabelle) mindestens 3x mit Leitungswasser abspülen; Wasser ablassen.VORSICHT: Kalkton produziert sehr feinen Staub und es wird empfohlen, beim Waschen eine Schutzmaske(Materialtabelle)zu tragen. Kalzinierten Ton als dünne Schicht (ca. 4 cm) in ein Autoklaventablett…

Representative Results

Wachstumsraten von Napa-KohlDie Samensterilisationsmethode wurde mit mehreren verschiedenen Napa Kohlsorten getestet (B. rapa var pekinese; Ergänzende Abbildung 1) von einer Reihe von verschiedenen Lieferanten und alle wuchsen konsequent mit ähnlichen Wachstumsraten. Jedoch, Testen der Methoden mit verschiedenen Arten von Brassica (B. rapa: Rüben lila Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. ca…

Discussion

Keimfreie Napa-Kohlpflanzen wurden verwendet, um die Dispersionsbeschränkung von Milchsäurebakterien in der Napa Kohlphyllosphäre17zu untersuchen. Keimfreie Napa-Kohlsorten können auch verwendet werden, um individuelles oder paarweises Wachstum in der Phyllosphäre zu testen (Abbildung 1). Methoden zur Herstellung von sterilem Pflanzenextrakt wurden für drei verschiedene Kohlsorten getestet: Rot, Grün und Napa. Jede dieser SVE fungiert als zuverlässiges Wachstu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den USDA-NIFA-Zuschuss unterstützt: 2017-67013-26520. Tracy Debenport und Claire Fogan leisteten technische Unterstützung und Ruby Ye und Casey Cosetta gaben hilfreiche Kommentare zu frühen Versionen dieses Manuskripts.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 20170-650
15 mL conical tubes Falcon 352096
7-way tray tray Sigma Magenta T8654
Amber Round Boston Glass Bottle GPS 712OZSPPK12BR Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters If you care (unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free) Austin's 50-010-45
Borosilicate Glass tubes VWR 47729-586
Calcined clay Turface MVP Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender Cuisinart Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors 7-389-A American Educational Products Ordered on Amazon.com
Ethanol VWR 89125-172
Forceps Aven 18434 Ordered on Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
KleenGuard M10 Kimberley-Clark 64240
Large plastic container Rubbermaid Ordered on Amazon.com
Light racks Gardner's Supply 39-357 full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps Millipore Sigma C1934
Man, Rogosa, and Sharpe Fisher Scientific DF0881-17-5 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP
Micropestle Carolina 215828 Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth Millipore Sigma M5519 Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl Sigma Aldrich S9888
Napa cabbage seeds Johnny's Select Seeds 2814G B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Used to make agar plates
Phosphate buffer saline Fisher Scientific 50-842-941 Teknova
Plant tissue culture box Sigma Magenta GA-7
Serologial pipettes VWR 89130-900
Sterile dowel Puritan 10805-018 Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter Nalgene 974103
Tryptic soy agar Fisher Scientific DF0370-17-3 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips Rainin 17007102
Yeast, peptone and dextrose Fisher Scientific DF0428-17-5 This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

References

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Miller, E. R., O’Mara Schwartz, J., Cox, G., Wolfe, B. E. A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation. J. Vis. Exp. (160), e61149, doi:10.3791/61149 (2020).

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