Summary

フィロスフィアおよび植物発酵における微生物叢の組立を研究するためのグノトバイオティクスシステム

Published: June 03, 2020
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Summary

単一の微生物種または多種微生物群集がキャベツの葉表面でどのように相互作用するかを評価することを可能にする無菌ナパキャベツの栽培方法が開発されました。滅菌野菜抽出物も提示され、植物発酵中のコミュニティ組成の変化を測定するために使用できます。

Abstract

フィロスフィアは、微生物によってコロニー形成され得る植物の地上部分であり、微生物群集のプロセスを同定するのに有用なモデルシステムである。このプロトコルは、ナパキャベツ植物のフィロスフィアにおける微生物群集ダイナミクスを研究するためのシステムを概説する。これは、焼成粘土と栄養ブロス基板を有する試験管で無菌植物を成長させる方法を説明しています。特定の微生物培養物を含む無菌植物の接種は、フィロスフィアにおける微生物の成長とコミュニティダイナミクスを測定する機会を提供する。発酵中に発生する微生物群集におけるキャベツのシフトから生成される無菌野菜抽出物の使用を通じても評価することができる。このシステムは、実験室で設定するには比較的簡単で安価であり、微生物群集の主要な生態学的な質問に対処するために使用することができます。また、フィロスフィアコミュニティの組成が植物発酵の微生物の多様性と品質にどのような影響を与えるかを理解する機会を提供します。グノトビオティックキャベツフィロスフィアコミュニティを開発するためのこのアプローチは、他の野生および農業植物種に適用することができます。

Introduction

フィロスフィアの微生物多様性は植物の健康を維持する上で重要な役割を果たし、また、植物が環境ストレス11、2、3、4、52,3,4,5に耐える能力に影響を与える可能性があります。ひいては、作物の健康は食品の安全と品質に直接影響を与える6,,7 .植物は生態系機能の役割を果たし、関連するマイクロバイオームは、植物がこれらの活動を行う能力に影響を与えるだけでなく、環境自体に直接影響を与える8.科学者たちはフィロスフィアの機能と組成を解読し始めているが、フィロスフィア微生物群集に影響を与える生態学的プロセスは99,1010を完全には理解していない。フィロスフィアマイクロバイオームは、マイクロバイオーム11の生態を研究するための優れた実験システムである。これらのコミュニティは比較的単純で、コミュニティメンバーの多くは標準のラボ メディア10、12,13で成長できます。

発酵野菜は、フィロスフィアのコミュニティ構造が重要な結果をもたらす1つのシステムです。ザワークラウトとキムチの両方において、植物の葉(ブラッシカ種のフィロスフィア)に自然に発生する微生物は、発酵14、15,15の接種として機能する。乳酸菌(LAB)は、植物性微生物叢のユビキタスメンバーと考えられているが、フィロスフィア16では豊富に存在し得る。発酵中の強力なアバイオティクス選択は、乳酸菌が豊富に増加することを可能にする微生物群集組成の変化を駆動します。LABが成長するにつれて、彼らは発酵野菜製品17の酸性環境を作り出す乳酸を生産する。フィロスフィアと発酵の間のリンクは、マイクロバイオームがどのように構造化されているかを理解するためのモデルとして野菜を使用する機会を提供します。

私たちは、無菌ナパキャベツを栽培し、スプレーボトルを使用して特定の微生物群集でそれらを接種する方法を開発しました。これは、個々の微生物または混合コミュニティのいずれかでキャベツを均等に接種する安価で信頼性の高い方法です。無菌野菜エキス(SVE)は、赤と緑のキャベツ(ブラッシカオレラセア)とナパキャベツ(B.ラパ)の3種類のキャベツタイプ/品種から開発されています。これらのSVEsに塩を添加すると、発酵環境が再現され、発酵マイクロバイオームアセンブリの小規模かつ比較的高スループットの実験研究が可能になります。これらの方法は、フィロスフィアにおける微生物群集と、フィロスフィアにおける微生物群集のダイナミクスを植物発酵の成功にどのように結び付けることができるかを研究するために使用することができる。

Protocol

1. 無菌キャベツの栽培 無菌キャベツの栽培に備える装置 微細な粉塵を除去するために焼成粘土を洗浄 水道水で少なくとも3倍の焼成粘土(材料表)をすすい。水を排出します。注意:焼成粘土は非常に微細なほこりを生成し、洗浄時に保護マスク(材料表)を着用することをお勧めします。 焼成粘土を薄い層(〜4cm)としてオートクレーブトレ…

Representative Results

ナパキャベツの成長率種子滅菌法は、いくつかの異なるナパキャベツ(B.ラパ・ヴァル・ペキネーゼ)で試験した。 補足図 1)多くの異なるサプライヤーから、すべてが同様の成長率で一貫して成長しました。しかし、 ブラシカ の異なる種でメソッドをテストする(B. ラパ: カブパープルトップ; B. オレラセア: カイロ…

Discussion

無菌ナパキャベツ植物は、ナパキャベツフィロスフィア17における乳酸菌の分散制限を研究するために使用されてきた。無菌ナパキャベツは、フィロスフィアの個々または対方向の成長をテストするためにも使用できます(図1)。無菌野菜抽出物の製造方法は、3種類のキャベツ(赤、緑、ナパ)でテストされています。これらの各 SVI は、信頼性の高い成長…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、USDA-NIFA助成金(2017-67013-26520)によって支えられていました。トレイシー・デベンポートとクレア・フォガンはテクニカルサポートを提供し、ルビー・イェとケイシー・コセッタはこの原稿の初期バージョンについて役立つコメントを提供しました。

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 20170-650
15 mL conical tubes Falcon 352096
7-way tray tray Sigma Magenta T8654
Amber Round Boston Glass Bottle GPS 712OZSPPK12BR Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters If you care (unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free) Austin's 50-010-45
Borosilicate Glass tubes VWR 47729-586
Calcined clay Turface MVP Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender Cuisinart Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors 7-389-A American Educational Products Ordered on Amazon.com
Ethanol VWR 89125-172
Forceps Aven 18434 Ordered on Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
KleenGuard M10 Kimberley-Clark 64240
Large plastic container Rubbermaid Ordered on Amazon.com
Light racks Gardner's Supply 39-357 full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps Millipore Sigma C1934
Man, Rogosa, and Sharpe Fisher Scientific DF0881-17-5 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP
Micropestle Carolina 215828 Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth Millipore Sigma M5519 Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl Sigma Aldrich S9888
Napa cabbage seeds Johnny's Select Seeds 2814G B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Used to make agar plates
Phosphate buffer saline Fisher Scientific 50-842-941 Teknova
Plant tissue culture box Sigma Magenta GA-7
Serologial pipettes VWR 89130-900
Sterile dowel Puritan 10805-018 Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter Nalgene 974103
Tryptic soy agar Fisher Scientific DF0370-17-3 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips Rainin 17007102
Yeast, peptone and dextrose Fisher Scientific DF0428-17-5 This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

References

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Miller, E. R., O’Mara Schwartz, J., Cox, G., Wolfe, B. E. A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation. J. Vis. Exp. (160), e61149, doi:10.3791/61149 (2020).

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