Drosophila에 있는 알콜 감도를 측정하는 현재 방법은 파리의 단을 시험하기 위하여 디자인됩니다. 우리는 단일 파리의 큰 숫자에 알코올 감산 도성을 평가하기위한 간단한, 저렴한 비용, 높은 처리량 분석을 제시한다. 이 방법은 특수 공구를 필요로하지 않으며 일반적인 재료를 사용하여 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다.
드로소필라 멜라노가스터는 알코올 민감도의 유전적 기초를 연구하는 훌륭한 모델을 제공한다. 인간 인구에 있는 연구 결과와는 대조적으로, Drosophila 모형은 유전 배경에 엄격한 통제를 허용하고, 동일 유전자형의 개별의 거의 무제한 수는 규정제한 없이 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 잘 통제된 환경 조건 하에서 급속하게 양육될 수 있습니다. 에탄올에 노출된 파리는 자세 조절, 침전 및 내성 발달을 포함하여 인간의 알코올 중독과 유사한 생리적 및 행동적 변화를 겪습니다. 여기에서는 많은 수의 단일 파리에서 알코올 감산 도/위를 평가하기 위한 간단하고 저렴한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 알코올 노출의 동기 개시를 가능하게 하는 셋업에서 24웰 세포 배양 플레이트에서 마취 없이 도입된 단일 파리의 비디오 녹화를 기반으로 합니다. 이 시스템은 한 사람이 8 시간 작업 기간 내에 최대 2,000 개의 파리에 대한 개별 에탄올 매연 데이터를 수집 할 수 있게합니다. 이 분석은 원칙적으로 모든 휘발성 물질에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 확장될 수 있으며 다른 비행 종을 포함한 다른 곤충에 대한 휘발성 물질의 급성 독성의 영향을 측정하기 위해 적용될 수 있습니다.
알코올 남용 및 알코올 중독에 국가 학회 보고 2015 과도 한 알코올 소비, 로 지정 된 “알코올 사용 장애”, 미국에서 추정된 1,600 만 명에 영향을. 알코올 남용 불리 한 생리 효과의 넓은 범위를 발생 하 고 미국에서 죽음의 주요 원인. 인간에서는, 감소된 감도, 또는 알콜에 반응의 낮은 수준은, 강한 유전 성분이 있고 알콜 사용 무질서1,2,23,및4를 개발의 고위험과 연관됩니다. 인간 인구에 대한 유전 적 위험 연구는 인구 혼화제, 다양한 발달 역사 및 환경 노출, 그리고 종종 다른 신경 정신 질환과 혼동되는 알코올 관련 표현형을 정량화하기 위해 자가보고 설문지에 의존하기 때문에 도전적입니다.
Drosophila melanogaster는 알콜 감도5,,6,,7,,8의유전 기초를 공부하는 우수한 모형을 제공합니다. Drosophila 모형은 유전 배경에 엄격한 통제를 허용하고, 동일 유전자형의 개별의 거의 무제한 수는 규정제한 없이 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 잘 통제된 환경 조건 하에서 급속하게 양육될 수 있습니다. 게놈에 있는 유전자의 대다수를 표적으로 하는 공개적으로 이용 가능한 돌연변이 및 RNAi 선 이외에, Drosophila melanogaster 유전 참조 패널 (DGRP)의 가용성, 완전한 게놈 서열을 가진 205의 근친 야생 유래 선의 인구, 게놈 전체 협회연구9,10를가능하게 했습니다. 이러한 연구는 에탄올11,,12에대한 발달 노출 시 개발 시간 및 생존 가능성에 미치는 영향과 관련된 유전 네트워크를 확인했습니다. 근본적인 생물학적 과정의 진화적 보존을 통해 인간 직립을 플라이 에 중첩시켜 번역 추론을 그릴 수 있습니다.
에탄올에 노출된 파리는 자세 조절8,침전, 내성 발달 을 포함하여 인간의 알코올 중독과 유사한 생리적 및 행동적 변화를 겪는다13,,14,,15. 초파리에서 알코올 유도 된 침열은 불청체계를 사용하여 정량화 될 수있다. 이들은파리가 16,,17,18을부착 할 수있는 경사진 메쉬 파티션이있는 122cm 길이의 수직 유리 기둥입니다., 적어도 50개의 파리(남녀는 별도로 분석될 수 있음)의 그룹이 컬럼의 상단에 도입되어 에탄올 증기에 노출된다. 자세 제어를 잃은 파리는 열을 통해 떨어지고 1 분 간격으로 수집됩니다. 평균 용출 시간은 알코올 중독에 대한 민감도의 척도역할을 합니다. 파리가 첫 번째 노출에서 회복 한 후 두 번째로 알코올에 노출되면 평균 용출 시간13,,15,,19,,20의변화에서 알 수 있듯이 허용 오차를 개발할 수 있습니다. 비ebriometer 분석은 알콜 침전 감도 및 내성의 발달과 관련되었던 유전자, 유전 네트워크 및 세포 통로의 확인으로 이끌어 내고 있는 반면12,,13,,14,,21,분석제는 시간 소모적이고, 낮은 처리량, 및 단일 파리에서 알콜 감도를 측정하기 위한 비효과이다.
치밀한 비단수계 설정이 필요하지 않은 대체 에탄올 침전 분석은 보다 편리한 측정을 허용하지만 여전히 처리량이 제한되어 있으며 일반적으로 개인,21, 22,23,,2324,,25가아닌 파리 그룹의 분석을 필요로 한다., 단일 파리를 평가하는 것은 사회적 행동에서 비롯된 것과 같은 집단 상호 작용으로 인한 혼란스러운 영향의 가능성을 최소화합니다. 여기에서는 많은 수의 단일 파리에서 알코올 감산 도/위를 평가하기 위한 간단하고 저렴한 고처리량 분석서를 제시합니다.
여기에서, 우리는 Drosophila melanogaster에있는 에탄올 노출 때문에 침전 시간을 평가하기 위한 간단하고, 저렴하고, 높은 처리량 방법을 제시합니다. 그룹 분석을 요구하는 많은 현재 방법과는 달리,이 분석은 한 사람이 8 시간 작업 기간 내에 ~ 2,000 파리에 대한 개별 적인 침동 시간 데이터를 수집 할 수 있습니다. 우리는 한 사람이 약 5 분 동안 식도 시간에 대한 48 파리를 득점 할 수 있음을 발견했다. 이 속도로, 2,000 파리는 약 4 시간에서 득점 할 수 있지만, 점수는 나중에 수행 할 수 있습니다. 우리의 분석으로, 대부분의 파리에 대한 기록 된 침전 시간은 100 % 에탄올의 1 mL에 노출5-15 분 범위. 에탄올농도가 낮거나 전달량이 작을수록 신분 공급 시간이 길어집니다.
침전 시간을 평가하기위한 현재의 방법은 쉽게 단일 개인15,,16,,17,,18,,19,,20,21,,22,23,,24,,25,26에대한 측정을 가능하게하지 않고 파리의 큰 숫자를 테스트해야합니다. 많은 현재 진정 및 감도 측정은 ST5022,,23,,24,파리의 50 %가 에탄올 노출의 결과로 진정되는 시점에 의존합니다. 파리 그룹에 대한 ST50을 획득하는 것이 이 분석법을 개발하는 주된 동기는 아니었지만, 비디오 녹화는 개별적으로 테스트된 파리의 그룹에 대한 ST50을 확인하고 주어진 기준(예: 자세 제어 상실)을 충족하는 파리의 백분율을 측정하는 데 사용될 수 있기 때문에 현재 방법에 비해 더 높은 유틸리티를 보여줍니다. 이러한 비디오 분석에는 추가 시간이 필요하다는 점에 유의해야 합니다.
현재 의 무당계 측정법과는 달리, 우리가 설명하는 방법은 설치하기 위하여 전문화한 공구를 요구하지 않으며 일반적인 물자를 사용하여 어떤 실험실든지에서 수행될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 개별 파리에 대한 안정적이고 일관된 완화 시간을 얻었습니다. 이 분석은 원칙적으로 휘발성 물질에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 확장될 수 있습니다. 이 분석은 또한 다른 비행 종을 포함한 다른 곤충에 대한 휘발성 의 급성 독성의 영향을 측정하기 위해 적용 될 수있다. 개별 적인 축삭 시간 데이터는 DGRP와 같은 인구 내의 표현형 변화의 정도를 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
우리는 에탄올 용액과의 직접적인 접촉을 방지하는 동시에 충분한 양의 에탄올 증기가 파리에 도달할 수 있도록 작은 곤충 스크린 메쉬를 사용했습니다. 화면 메쉬 위에 있는 흰색 치즈 천 레이어는 플라이와 아래 표면 사이의 시각적 대비를 제공하며 파리가 화면 메시에 걸리지 않도록 하여 자세 제어손실의 모호한 결정을 초래할 수 있습니다. 물과 공기에 다공성인 시판되는 멤브레인은 일관성 없는 결과를 주었으며 에탄올 증기에 불충분하게 침투할 수 없었습니다. 우물 내 의 플라이 위치의 결과로 에탄올 노출의 변동을 최소화하는 균일한 다공성 물질이기 때문에 의도적으로 작은 곤충 스크린 메쉬를 사용했습니다. 사용 가능한 물질에 따라 이 프로토콜을 수정할 수 있지만, 제어된 행동 챔버, 비행에 가까운 90%-100% 에탄올에 대한 접근, 균일한 에탄올 노출을 권장합니다.
세포 배양 플레이트 내의 플라이 위치는 위치 편향을 피하기 위해 복제 사이에 무작위로 배정되어야 합니다. 여러 날에 걸쳐 이 분석법의 사용을 요구하고 따라서 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 환경 적 변화의 대상이 되는 더 큰 실험(예를 들어, 기압의변화)(27)의경우, 특히 다른 선 및/또는 성별을 서로 비교해야 하는 경우, 매일 같은 시간에 파리를 테스트하고 며칠 동안 무작위로 테스트하는 것이 좋습니다.
우리가 개발한 방법은 급성 알콜 노출의 효력을 측정하는 위해 가장 적합하지만 소비 데이터를 얻거나 모델링 중독을 얻기에는 적합하지 않습니다. 그러나 이 분석에서 얻은 알코올 중독 민감도 데이터는 알코올 관련 표현형의 다른 측정값과 통합될 수 있다. 시스템의 한 가지 제한은 표준 세포 배양 판의 수직 높이가 전체 활동 이나 운동의 상세한 평가를 위해 비디오로 쉽게 추적 할 수없는 수직 비행 운동을 허용한다는 것입니다. 그러나 이러한 제한은 침전 시간의 정확한 평가에 영향을 미치지 않습니다. 다른 유전자형의 파리를 사용하는 경우 (예를 들어, DGRP 유래 아웃브레드 집단28에서),이 분석은 또한 대량 DNA 염기서열 분석 및 극단적인 QTL 매핑을 위한 대조적인 표현형을 가진 파리의 풀을 수집하는 개별 파리의 회수를 가능하게 한다29,,30. 전반적으로, 이 분석은 단일 파리의 큰 숫자에 알코올 중독 데이터의 신속하고 저렴한 수집을 허용합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 TFCM 및 RRHA에 건강의 국가 학회에서 보조금 DA041613 및 GM128974에 의해 지원되었다.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |