目前测量果蝇酒精敏感性的方法旨在测试苍蝇群。我们提出了一种简单、低成本、高通量的测定,用于评估大量单蝇的酒精镇镇敏感性。该方法不需要专用工具,可在任何实验室使用常用材料进行。
果蝇黑色素气仪为研究酒精敏感性的遗传基础提供了一个很好的模型。与对人类的研究相比,果蝇模型允许严格控制遗传背景,在不受监管限制和相对较低的成本的情况下,几乎无限数量的同一基因型个体可以在不受监管限制和相对较低的成本的情况下迅速饲养。接触乙醇的苍蝇经历类似于人类酒精中毒的生理和行为变化,包括丧失姿势控制、镇镇和耐受性。在这里,我们描述了一种简单、低成本、高通量测定,用于评估大量单蝇的酒精镇镇敏感性。该测定基于在24孔细胞培养板中引入的单个苍蝇的视频记录,这种培养板能够同步启动酒精暴露。该系统使一个人能够在8小时的工作时间内收集多达2,000只苍蝇的单个乙醇镇化数据。原则上,可以扩大该测定的范围,以评估暴露于任何挥发性物质的影响,并用于测量挥发物急性毒性对其他昆虫,包括其他苍蝇物种的影响。
国家酒精滥用和酒精中毒研究所报告说,2015年,被指定为”酒精使用障碍”的过度饮酒影响了美国约1 600万人。酒精滥用引起广泛的不良生理影响,是美国的主要死亡原因。在人类中,敏感性降低或对酒精反应水平低,具有很强的遗传成分,并且与患酒精使用障碍的风险较高1,1,2,3,4。2,3,4由于人口混合、不同的发育史和环境暴露,以及依靠自报问卷来量化与酒精相关的表型,因此对人类种群的遗传风险研究具有挑战性,这些表型往往与其他神经精神病条件混淆。
果蝇黑色素加斯特提供了一个优秀的模型,以研究酒精敏感性的遗传基础5,5,6,7,8。,7,8果蝇模型允许严格控制遗传背景,在不受监管限制和相对较低的成本的情况下,几乎无限数量的同一基因型个体可以在控制良好的环境条件下迅速饲养。除了公开提供的突变和RNAi系,针对基因组中的大多数基因,果蝇黑色素基因参考小组(DGRP),一个人口205近亲野生派生线与完整的基因组序列,已经使全基因组关联研究9,10。109这些研究已经确定了与发育时间和生存能力对发育时间的影响有关的遗传网络11,12。,12基本生物过程的进化保护使得通过将人类正交器叠加到其飞行对应物上来得出转化推理。
接触乙醇的苍蝇经历类似于人类酒精中毒的生理和行为变化,包括丧失姿势控制8、镇化以及耐受性13、14、15。14,1513酒精诱导镇平在果蝇可以量化使用测光仪。这些是122厘米长的垂直玻璃柱,带有倾斜的网状隔板,苍蝇可以附着16、17、18。,17,18在柱的顶部引入至少50只苍蝇(性别可以单独分析),并暴露于乙醇蒸气中。失去姿势控制的苍蝇会从柱子上掉下来,每隔1分钟收集一次。平均洗脱时间是衡量酒精中毒的敏感性的尺度。当苍蝇在第一次接触后第二次接触酒精时,它们就会产生耐受性,从平均洗脱时间13、15、19、20,19,的变化中可以明显看出。13,20而测值仪测定结果已导致基因、遗传网络和细胞通路的识别,这些基因、遗传网络和细胞通路与酒精镇定敏感性和耐受性12、13、14、21,14,的发展有关,而该测定是耗时的、低通量的,对测量单蝇的酒精敏感性无效。12,21
替代乙醇镇静测定,不需要精心设计的测压仪设置允许更方便的测量,但仍然有限的吞吐量,一般需要分析苍蝇群,而不是个人21,22,23,24,25。21,22,23,24,25评估单只苍蝇会最大限度地减少因群体互动(如社会行为引起的相互作用)而产生混淆效应的可能性。在这里,我们提出了一种简单、低成本、高通量的测定,用于评估大量单蝇的酒精镇镇敏感性。
在这里,我们提出了一种简单、廉价、高通量的方法,用于评估由于果蝇醇丙醇的乙醇暴露引起的镇理时间。与许多当前需要组分析的方法不同,此测定使单个人员能够在 8 小时工作时间内收集 2,000 条苍蝇的单个镇节时间数据。我们发现,一个人可以得分48苍蝇的镇定时间在大约5分钟。以这个速度,2000只苍蝇可以在大约4小时内得分,但稍后可以进行评分。通过我们的测定,大多数苍蝇的镇水时间从5-15分钟到1mL的100%乙醇。乙醇浓度降低或输送量变小将导致镇化时间延长。
现时评估镇流时间的方法,需要测试大量苍蝇,而无须,轻易对单位15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26,16,17,18,19,20,21进行测量。22,23,24,25,26许多目前的镇静和敏感性测定依赖于ST50 22,23,24,该时间点50%的苍蝇由于乙醇暴露而镇静。22,23,24虽然获得ST50的苍蝇组不是开发这种测定的主要动机,但与目前的方法相比,录像的效用更高,因为录音可用于确定单独测试的苍蝇群的ST50,并测量满足给定标准的苍蝇的百分比(例如,姿势控制损失)。应当指出,这种视频分析需要更多的时间。
与当前的测光仪测定不同,我们描述的方法不需要专门的工具来设置,并且可以使用常用材料在任何实验室中执行。使用这种方法,我们获得了可靠和一致的镇定时间为个别苍蝇。原则上,可以延长测定范围,以评估接触任何挥发性物质的影响。该测定还可用于测量挥发物急性毒性对其他昆虫,包括其他苍蝇物种的影响。单个镇定时间数据可用于评估总体(如 DGRP)中的符号变化程度。
我们使用小昆虫网,以防止直接接触乙醇溶液,同时允许足够的乙醇蒸气到达苍蝇。屏幕网格顶部的白色奶酪布层提供苍蝇和下面表面之间的视觉对比,并确保苍蝇不会被捕获到屏幕网格中,这可能导致模棱两可的姿势控制损失确定。对水和空气多孔的商用膜结果不一致,对乙醇蒸气的穿透性不足。我们故意使用小昆虫网,因为它是一种均匀多孔材料,能最大限度地减少由于井内飞行位置造成的乙醇暴露变化。可以根据现有材料修改该协议,尽管我们建议使用受控行为室,在苍蝇附近获得 90%-100% 乙醇,并均匀接触乙醇。
细胞培养板内的飞点位置应在复制之间随机化,以避免位置偏置。对于需要在多日内使用这种测定,因此受环境变化影响测定结果(例如,气压变化)影响的大型实验,我们强烈建议每天在同一时间测试苍蝇,并在数日内和几天内随机进行,特别是当不同的线条和/或性别相互比较时。
我们开发的方法最适合测量急性酒精暴露的影响,但不适合获取消费数据或模拟成瘾。然而,从该测定中获得的酒精镇定敏感性数据可以与其他与酒精相关的表型测量相结合。该系统的一个限制是标准细胞培养板的垂直高度允许垂直飞行运动,无法通过视频轻松跟踪,以便详细评估整体活动或运动。但是,此限制不影响镇定时间的准确评估。当使用不同基因型的苍蝇(例如,在DGRP衍生的外种种群28),这种测定还允许检索单个苍蝇收集具有对比表型的苍蝇池,用于批量DNA测序和极端QTL映射29,30。,30总体而言,这种测定允许快速、廉价地收集大量单蝇的酒精镇镇化数据。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院向TFCM和RRHA提供的DA041613和GM128974赠款的支持。
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |