שיטות נוכחיות למדידת רגישות האלכוהול בדרוזופילה נועדו לבחון קבוצות של זבובים. אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, התפוקה גבוהה הערכה להערכת רגישות הרגעה אלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. השיטה אינה דורשת כלים מיוחדים וניתן לבצעו בכל מעבדה המשתמשת בחומרים משותפים.
Drosophila ילה melanoster מספק מודל מצוין כדי ללמוד את התחתון הגנטי של רגישות לאלכוהול. בניגוד למחקרים באוכלוסיות אנושיות, דגם Drosophila ילה מאפשר שליטה קפדנית על רקע גנטי, ולמעשה מספר בלתי מוגבל של אנשים מאותו גנוטיפ ניתן לגדל במהירות בתנאים סביבתיים מבוקרת היטב ללא הגבלות רגולטוריות בעלות נמוכה יחסית. זבובים חשופים לאתנול עוברים שינויים פיסיולוגיים והתנהגותיים הדומים לשכרות אלכוהול אנושיים, כולל אובדן שליטה באמצעות הרדמה, הרגעה ופיתוח של סובלנות. כאן, אנו מתארים פשוט, בעלות נמוכה, התפוקה הגבוהה שיטת להערכת רגישות הרגעה לאלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. העיבוד מבוסס על הקלטת וידאו של זבובים בודדים הציג ללא הרדמה ב 24-היטב לוחיות התרבות התא בהגדרה המאפשרת חניכה סינכרונית של חשיפה לאלכוהול. המערכת מאפשרת לאדם אחד לאסוף נתונים בודדים הרדמה האתנול על רבים כמו 2,000 זבובים בתוך תקופת עבודה של 8 h. האפשרות, בעיקרון, להיות מורחבת כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לכל חומר נדיף ולהחיל על השפעות מדידה של רעילות חריפה של וולאטיקלס על חרקים אחרים, כולל מינים אחרים זבוב.
המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ו אלכוהוליזם מדווח כי ב 2015 צריכת אלכוהול מוגזמת, המיועד כ “הפרעת שימוש באלכוהול”, השפיעו על 16,000,000 אנשים בארצות הברית. שימוש לרעה באלכוהול גורם למגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות לוואי והוא הגורם העיקרי למוות בארה ב. בבני אדם, רגישות מופחת, או רמה נמוכה של תגובה לאלכוהול, יש מרכיב גנטי חזק והוא קשור לסיכון גבוה יותר לפתח הפרעות שימוש באלכוהול1,2,3,4. מחקרי הסיכון הגנטי על אוכלוסיות אנושיות מאתגרת בגלל מוספים לאוכלוסיה, היסטוריה התפתחותית מגוונת וחשיפות סביבתיות, והסתמכות על שאלונים שדווחו על-ידי ככמת להפנוטיפים הקשורים לאלכוהול, אשר לעיתים קרובות מבולבל בתנאים נוירופסיכיאטריים אחרים.
Drosophila ילה melanoster מספק מודל מצוין כדי ללמוד את התחתון הגנטי של רגישות לאלכוהול5,6,7,8. דגם Drosophila ילה מאפשר שליטה קפדנית על הרקע הגנטי, וכמעט מספר בלתי מוגבל של אנשים מאותו גנוטיפ אותו ניתן לגדל במהירות תחת תנאים סביבתיים מבוקרת היטב ללא הגבלות רגולטוריות בעלות נמוכה יחסית. בנוסף על מוטציות זמינות בפומבי ו rnai קווים היעד רוב הגנים בגנום, הזמינות של הפאנל התייחסות גנטית של drosophila ילה מלאנוסטר (DGRP), אוכלוסיה של 205 שורות מלאות פראי עם רצפי הגנום המלא, אפשרה הגנום9הרחב לימודיהתאגדות 9,10. מחקרים כאלה זיהו רשתות גנטיות הקשורות להשפעות על זמן פיתוח וכדאיות על חשיפה התפתחותית לאתנול11,12. שימור אבולוציוני של תהליכים ביולוגיים בסיסיים מאפשר להסיק מסקנות על ידי הטלת הרושם האנושי על עמיתיהם הטסים.
זבובים חשופים לאתנול עוברים שינויים פיסיולוגיים והתנהגותיים הדומים לשיכרון אלכוהול אנושי, כולל אובדן שליטה בפוסט-טראומטית8, הרגעה ופיתוח של סובלנות13,14,15. ניתן לכמת את השפעת ההרדמה בדרוסופילה באמצעות inebriometers. אלה הם 122 ס מ לאורך עמודות זכוכית אנכית עם מחיצות רשת משופע שבהם זבובים יכולים לצרף16,17,18. קבוצה של לפחות 50 זבובים (המינים יכולים להיות מנותח בנפרד) מוצגים בחלק העליון של הטור וחשופים אדים אתנול. זבובים שאיבדו את השליטה בדואר האלקטרוני נופלים דרך הטור ונאספים במרווחי זמן של 1 דקות. הזמן הממוצע משמש מידה של רגישות הרעלת אלכוהול. כאשר זבובים חשופים אלכוהול בפעם השנייה לאחר שהחלים מן החשיפה הראשונה, הם יכולים לפתח סובלנות, כפי שניכר מתוך משמרת מתכוון הימנעות ממוצע זמן13,15,19,20. בעוד inebriometer בחני הובילו לזיהוי של גנים, רשתות גנטיות, ומסלולים סלולריים הקשורים עם רגישות הרגעה לאלכוהול ופיתוח של סובלנות12,13,14,21, את היכולת לגזול זמן רב, תפוקה נמוכה, ולא יעיל למדידת רגישות לאלכוהול בזבובים בודדים.
הרגעה האתנול האלטרנטיבי בחני כי לא דורשים את הגדרת inebriometer מורכבים לאפשר מדידות נוח יותר אבל הם עדיין מוגבלים תפוקה בדרך כלל דורשים ניתוחים של קבוצות של זבובים ולא יחידים21,22,23,24,25. הערכת זבובים בודדים מקטינה את הפוטנציאל להשפעות מייסדים עקב אינטראקציות קבוצתיות, כגון אלה הנובעות מהתנהגויות חברתיות. כאן, אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, שיטת תפוקה גבוהה להערכת רגישות הרגעה לאלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה, זולה, תפוקה גבוהה להערכת זמן הרגעה עקב חשיפה אתנול ב Drosophila ילה melanogaster. שלא כמו שיטות נוכחיות רבות, הדורשות ניתוח קבוצתי, שיטה זו מאפשרת לאדם אחד לאסוף נתוני זמן הרגעה בודדים עבור ~ 2,000 זבובים בתוך תקופת עבודה של 8 h. מצאנו כי אדם אחד יכול להבקיע 48 זבובים בזמן ההרדמה בערך 5 דקות. בקצב זה, 2,000 זבובים יכולים להיות הבקיע כ 4 h, אם כי הבקיע ניתן לנהל מאוחר יותר. עם הצורך שלנו, זמן ההרדמה מוקלט עבור רוב הזבובים נע בין 5-15 דקות בחשיפה ל 1 mL של 100% אתנול. ריכוזים נמוכים יותר של אתנול או אמצעי מסירה קטנים יותר יגרמו זמני הרגעה ארוכים יותר.
השיטות הנוכחיות להערכת זמן הרגעה דורשות בדיקת מספר גדול של זבובים מבלי לאפשר בקלות מדידות על אנשים בודדים15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. הרגעה ורגישות הנוכחי רבים מוסר להסתמך על ST5022,23,24, הזמן שבו 50% של זבובים הם הרגעה כתוצאה של חשיפה אתנול. למרות השגת ST50 עבור קבוצות של זבובים לא היתה המוטיבציה העיקרית לפיתוח הספק הזה, הקלטות וידאו להפגין שירות גבוה יותר לעומת השיטות הנוכחיות, כמו ההקלטות ניתן להשתמש כדי לוודא את ST50 עבור קבוצות של זבובים נבדק בנפרד כדי למדוד את אחוז הזבובים המקיימים קריטריון נתון (למשל, אובדן של שליטה בדואר) בכל יצוין כי ניתוח וידאו כזה ידרוש זמן נוסף.
בניגוד inebriometer assays הנוכחי, השיטה שאנו מתארים אינו דורש כלים מיוחדים להגדיר וניתן לבצע בכל מעבדה באמצעות חומרים משותפים. באמצעות שיטה זו, הצלחנו להשיג זמן הרגעה אמין ועקבי עבור זבובים בודדים. ניתן להרחיב את האפשרות, בעיקרון, להעריך את השפעות החשיפה לכל חומר נדיף. ניתן גם ליישם את האפשרות למדוד את ההשפעות של רעילות חריפה של וולאטיקלס על חרקים אחרים, כולל מינים אחרים זבוב. בודדים זמן הרגעה נתונים ניתן להשתמש כדי להעריך את מידת וריאציה פנוטימית בתוך אוכלוסיה, כגון DGRP.
השתמשנו שינוי מסך קטן של חרק כדי למנוע מגע ישיר עם פתרון אתנול תוך מתן כמויות נאותה של אדי אתנול כדי להגיע לזבוב. שכבת הגזה הלבנה על גבי רשת שינוי המסך מספקת ניגוד חזותי בין הזבוב לבין המשטח שמתחת ומבטיחה שהזבובים לא יתפסו ברשת שינוי המסך, דבר שעלול להוביל לקביעת הפסד רב-משמעי של איבוד שליטה בדואר. ממברנות זמינים מסחרית כי הם נקבובי למים ואוויר נתן תוצאות לא עקביות היו נחדרת מספיק כדי אדים אתנול. במתכוון השתמשנו בכוונת מסך קטן ברשת החרקים משום שהוא חומר נקבובי אחיד המקזער את הווריאציה בחשיפה לאתנול כתוצאה מתנוחת הזבוב בתוך הבאר. ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול זה על בסיס חומרים זמינים, למרות שאנו ממליצים על תא התנהגותי מבוקר, גישה ל-90%-100% אתנול קרוב לזבוב, וחשיפה אחידה לאתנול.
מיקום לטוס בתוך לוחות תרבות התא צריך להיות אקראי בין משכפל כדי למנוע הטיה מיקום. לניסויים גדולים יותר הדורשים שימוש בטיפול זה לאורך ימים מרובים ולכן כפופים לווריאציה סביבתית שיכולה להשפיע על תוצאות הטיפול (למשל, שינויים בלחץ ברומטרי)27, מומלץ מאוד לבדוק זבובים באותו הזמן בכל יום ובאופן אקראי הן בתוך ומעבר לימים, במיוחד אם שורות ו/או
השיטה שפיתחנו מתאימה ביותר למדידת ההשפעה של חשיפה לאלכוהול חריפה אך אינה מתאימה להשגת נתוני צריכה או התמכרות לדוגמנות. אלכוהול הרגעה רגישות נתונים שהתקבלו מתוך הנתון הזה יכול, עם זאת, להיות משולב עם אמצעים אחרים של הקשורות לאלכוהול פנוטיפים. מגבלה אחת של המערכת היא כי הגובה האנכי של הלוחות הסטנדרטיים של תרבות התא מאפשר תנועה לטוס אנכי כי לא ניתן לעקוב בקלות על ידי וידאו להערכה מפורטת של הפעילות הכללית או תנועה. עם זאת, מגבלה זו אינה משפיעה על הערכה מדויקת של זמן ההרדמה. כאשר משתמשים בזבובים של גנוסוגים שונים (למשל, ב-DGRP-נגזר האוכלוסייה28), שיטת הפעולה מאפשרת גם לאחזור של זבובים בודדים כדי לאסוף בריכות של זבובים עם פנוטיפים מנוגדים עבור רצפי DNA בצובר ומיפוי qtl קיצוני29,30. בסך הכל, שיטת הפעולה מאפשרת איסוף מהיר וזול של מידע על הרדמה לאלכוהול על מספר גדול של זבובים בודדים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DA041613 ו GM128974 מן המכונים הלאומיים לבריאות ל-TFCM ו RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |