Gli attuali metodi per misurare la sensibilità all’alcol nella Drosophila sono progettati per testare gruppi di mosche. Vi presentiamo un semplice, a basso costo, ad alto costo di analisi per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole. Il metodo non richiede strumenti specializzati e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio utilizzando materiali comuni.
La Drosophila melanogaster fornisce un ottimo modello per studiare le basi genetiche della sensibilità alcolica. A differenza degli studi condotti nelle popolazioni umane, il modello della Drosophila consente un rigoroso controllo sul background genetico, e un numero praticamente illimitato di individui dello stesso genotipo può essere allevato rapidamente in condizioni ambientali ben controllate senza restrizioni normative e a costi relativamente bassi. Le mosche esposte all’etanolo subiscono cambiamenti fisiologici e comportamentali che assomigliano all’intossicazione da alcol umano, compresa la perdita di controllo posturale, la sedazione e lo sviluppo della tolleranza. Qui, descriviamo un semplice, basso costo, ad alto costo saggio saggio per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole. Il saggio si basa sulla registrazione video di mosche singole introdotte senza anestesia in piastre di coltura cellulare a 24 pozzi in un set-up che consente l’avvio sincrono dell’esposizione all’alcol. Il sistema consente a una singola persona di raccogliere dati di sedazione di etanolo individuali su un terreno di lavoro di ben 2.000 mosche. Il saggio può, in linea di principio, essere esteso per valutare gli effetti dell’esposizione a qualsiasi sostanza volatile e applicato per misurare gli effetti della tossicità acuta di sostanze volatili su altri insetti, comprese altre specie di mosca.
Il National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism riferisce che nel 2015 il consumo eccessivo di alcol, designato come “disordine di consumo di alcol”, ha colpito circa 16 milioni di persone negli Stati Uniti. L’abuso di alcol provoca una vasta gamma di effetti fisiologici avversi ed è una delle principali cause di morte negli Stati Uniti. Negli esseri umani, diminuzione della sensibilità, o un basso livello di risposta all’alcol, ha1una forte componente genetica ed è associato a un rischio maggiore di sviluppare disturbi da alcol 1,2,3.4 Gli studi sul rischio genetico sulle popolazioni umane sono impegnativi a causa dell’incomlsione della popolazione, delle diverse storie di sviluppo e delle esposizioni ambientali e della dipendenza da questionari auto-riportati per quantificare i fenotipi correlati all’alcol, spesso confusi con altre condizioni neuropsichiatriche.
La Drosophila melanogaster fornisce un ottimo modello per studiare le basi genetiche della sensibilità alcolica5,6,7,8. Il modello della Drosophila consente un rigoroso controllo sul background genetico, e un numero praticamente illimitato di individui dello stesso genotipo può essere allevato rapidamente in condizioni ambientali ben controllate senza restrizioni normative e a costi relativamente bassi. Oltre alle mutazioni pubblicamente disponibili e alle linee RNAi che si rivolgono alla maggior parte dei geni nel genoma, la disponibilità del pannello di riferimento genetico della Drosophila melanogaster (DGRP), una popolazione di 205 linee derivate selvatiche con sequenze complete del genoma, ha permesso studi di associazione a livello di genoma9,10. Tali studi hanno identificato reti genetiche associate agli effetti sui tempi di sviluppo e sulla fattibilità dopo l’esposizione allo sviluppo all’etanolo11,12. La conservazione evolutiva dei processi biologici fondamentali consente di trarre deduzioni traslazionali sovrapponendo gli ortologhi umani alle loro controparti di mosca.
Le mosche esposte all’etanolo subiscono cambiamenti fisiologici e comportamentali che assomigliano all’intossicazione da alcol umana, compresa la perdita di controllo posturale8, sedazione e sviluppo della tolleranza13,14,15. La sedazione indotta dall’alcol nella Drosophila può essere quantificata utilizzando inebriometri. Si tratta di colonne di vetro verticali lunghe 122 cm con partizioni a rete inclinate a cui le mosche possono attaccare16,17,18. Un gruppo di almeno 50 mosche (i sessi possono essere analizzati separatamente) vengono introdotti nella parte superiore della colonna ed esposti a vapori di etanolo. Le mosche che perdono il controllo posturale cadono attraverso la colonna e vengono raccolte a intervalli di 1 min. Il tempo medio di eluizione serve come misura di sensibilità all’intossicazione da alcol. Quando le mosche sono esposte all’alcol una seconda volta dopo il recupero dalla prima esposizione, possono sviluppare tolleranza, come evidente da un cambiamento nel tempo medio di eluizione13,15,1919,20. Mentre i saggi inebriometri hanno portato all’identificazione di geni, reti genetiche e vie cellulari associate alla sensibilità alla sedazione di alcol e allo sviluppo della tolleranza12,13,14,21, il saggio richiede tempo, basso throughput e inefficace per misurare la sensibilità all’alcol nei singoli moscerini.
I saggi alternativi di sedazione di etanolo che non richiedono l’elaborata configurazione dell’inebriometro consentono misurazioni più convenienti ma sono ancora limitati nella produzione e generalmente richiedono analisi di gruppi di mosche piuttosto che di individui21,22,23,24,25.25 La valutazione di singole mosche riduce al minimo il potenziale di effetti di confusione dovuti a interazioni di gruppo, come quelle derivanti da comportamenti sociali. Qui, presentiamo un semplice, basso costo, ad alto costo di analisi per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole.
Qui, presentiamo un metodo semplice, economico e ad alto contenuto di velocità effettiva per valutare il tempo di sedazione a causa dell’esposizione all’etanolo in Drosophila melanogaster. A differenza di molti metodi attuali, che richiedono analisi di gruppo, questo saggio consente a una singola persona di raccogliere dati sul tempo di sedazione individuale per 2.000 dollari volano in un periodo di lavoro di 8 h. Abbiamo scoperto che una singola persona può segnare 48 mosche per il tempo di sedazione in circa 5 min. A questo ritmo, 2.000 mosche possono essere segnate in circa 4 h, anche se il punteggio può essere condotto in un secondo momento. Con il nostro saggio, il tempo di sedazione registrato per la maggior parte delle mosche varia da 5 a 15 min ad un’esposizione a 1 mL di 100% di etanolo. Concentrazioni più basse di etanolo o volumi di consegna più piccoli si tradurranno in tempi di sedazione più lunghi.
Gli attuali metodi per valutare il tempo di sedazione richiedono un test elevato di mosche senza abilitare facilmente le misurazioni su singoli individui15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Molti attuali saggi di sedazione e sensibilità si basano su ST5022,23,24, il momento in cui il 50% delle mosche sono sedati a causa dell’esposizione all’etanolo. Anche se ottenere la ST50 per gruppi di mosche non era la motivazione principale per lo sviluppo di questo saggio, le registrazioni video dimostrano una maggiore utilità rispetto ai metodi attuali, in quanto le registrazioni possono essere utilizzate per accertare la ST50 per gruppi di mosche testate individualmente e per misurare la percentuale di mosche che soddisfano un determinato criterio (ad esempio, perdita di controllo posturale) in qualsiasi momento. Va notato che tali analisi video richiederebbero più tempo.
A differenza degli attuali saggi inebriometrici, il metodo che descriviamo non richiede strumenti specializzati per l’installazione e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio utilizzando materiali comuni. Utilizzando questo metodo, abbiamo ottenuto tempi di sedazione affidabili e coerenti per le singole mosche. Il saggio può, in linea di principio, essere esteso per valutare gli effetti dell’esposizione a qualsiasi sostanza volatile. Il saggio può anche essere applicato per misurare gli effetti della tossicità acuta delle sostanze volatili su altri insetti, comprese altre specie di mosca. I dati sui singoli tempi di sedazione possono essere utilizzati per valutare l’entità della variazione fenotipica all’interno di una popolazione, come il DGRP.
Abbiamo usato piccole reti a schermo di insetti per impedire il contatto diretto con la soluzione di etanolo, consentendo al contempo quantità adeguate di vapori di etanolo per raggiungere la mosca. Lo strato di garza bianca sulla parte superiore della rete dello schermo fornisce un contrasto visivo tra la mosca e la superficie sottostante e assicura che le mosche non vengano catturate nella mesh dello schermo, il che potrebbe portare a una determinazione ambigua della perdita del controllo posturale. Le membrane disponibili in commercio che sono porose all’acqua e all’aria hanno dato risultati incoerenti e non erano sufficientemente penetrabili ai vapori di etanolo. Abbiamo usato intenzionalmente piccole reti di schermi di insetti perché è un materiale uniformemente poroso che riduce al minimo la variazione nell’esposizione all’etanolo a causa della posizione della mosca all’interno di un pozzo. È possibile apportare modifiche a questo protocollo sulla base di materiali disponibili, anche se si consiglia una camera comportamentale controllata, l’accesso al 90%-100% di etanolo vicino alla mosca e l’esposizione uniforme agli etanoli.
La posizione del volo all’interno delle piastre di coltura cellulare deve essere randomizzata tra le repliche per evitare distorsioni posizionali. Per esperimenti più grandi che richiedono l’uso di questo saggio in più giorni e sono quindi soggetti a variazioni ambientali che potrebbero influenzare i risultati di analisi (ad esempio, i cambiamenti nella pressione barometrica)27, consigliamo vivamente che le mosche siano testate contemporaneamente ogni giorno e randomizzate sia all’interno che all’interno dei giorni, soprattutto se diverse linee e/o sessi devono essere confrontati l’uno con l’altro.
Il metodo che abbiamo sviluppato è più adatto per misurare l’effetto dell’esposizione acuta all’alcol, ma non è adatto per ottenere dati di consumo o modellare la dipendenza. I dati di sensibilità alla sedazione dell’alcol ottenuti da questo saggio possono tuttavia essere integrati con altre misure di fenotipi correlati all’alcol. Una limitazione del sistema è che l’altezza verticale delle piastre di coltura cellulare standard consente il movimento verticale della mosca che non può essere facilmente rintracciato tramite video per una valutazione dettagliata dell’attività complessiva o della locomozione. Tuttavia, questa limitazione non influisce sulla valutazione accurata del tempo di sedazione. Quando si utilizzano mosche di genotipi diversi (ad esempio, nelle popolazioni di razza fuorirazza DGRP28), questo test consente anche il recupero di singole mosche per raccogliere pozze di mosche con fenotipi contrastanti per il sequenziamento del DNA sfuso e la mappatura QTL estrema29,30. Nel complesso, questo test consente una rapida e poco costosa raccolta di dati di sedazione di alcol su un gran numero di mosche singole.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni DA041613 e GM128974 dai National Institutes of Health a TFCM e RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |