ショウジョウバエのアルコール感受性を測定する現在の方法は、ハエの群をテストするように設計されています。多数の単一ハエにおけるアルコール沈殿感度を評価するための、シンプルで低コストで高スループットのアッセイを提供します。この方法は特殊なツールを必要とせず、共通の材料を使用して任意の研究室で行うことができます。
ショウジョウバエメラノガスターは、アルコール感受性の遺伝的基盤を研究するための優れたモデルを提供します。ヒト集団の研究とは対照的に、ショウジョウバエモデルは遺伝的背景を厳密に制御することができ、同じ遺伝子型の事実上無制限の個体数は、規制上の制限なしに比較的低コストで十分に制御された環境条件下で迅速に飼育することができる。エタノールにさらされたハエは、姿勢制御の喪失、沈下、耐性の発達など、ヒトのアルコール中毒に似た生理学的および行動的変化を受ける。ここでは、多数の単一ハエにおけるアルコール沈殿感度を評価するための、シンプルで低コストで高スループットのアッセイについて説明する。このアッセイは、アルコール暴露の同期開始を可能にするセットアップで、24ウェル細胞培養プレートに麻酔なしで導入された単一のハエのビデオ録画に基づいています。このシステムにより、1人の人が8時間の作業期間内に2,000個ものハエに対して個々のエタノール沈めデータを収集することができます。アッセイは、原則として、任意の揮発性物質への暴露の影響を評価するために拡張することができ、他のフライ種を含む他の昆虫に対する揮発性の急性毒性の影響を測定するために適用することができる。
アルコール乱用・アルコール依存症研究所は、2015年に「アルコール使用障害」に指定された過度のアルコール摂取が米国の推定1600万人に影響を与えたと報告しています。アルコール乱用は、有害な生理学的影響の広い範囲を引き起こし、米国の主要な死因である。ヒトにおいて、感受性の低下、またはアルコールに対する応答の低レベルは、強力な遺伝要素を有し、アルコール使用障害11、2、3、42,3,4を発症するリスクが高いと関連している。ヒト集団の遺伝的リスク研究は、集団混和、多様な発達履歴および環境暴露、および他の神経精神状態としばしば混乱しているアルコール関連の型を定量化するための自己報告されたアンケートへの依存のために困難である。
ショウジョウバエメラノガスターは、,アルコール感受性5、6、7、86の遺伝的基盤を5研究するための優れたモデル7を8提供します。ショウジョウバエモデルは遺伝的背景を厳密に制御することができ、同じ遺伝子型の事実上無制限の個体数は、規制上の制限なしに比較的低コストで十分に制御された環境条件下で迅速に飼育することができます。ゲノム中の遺伝子の大部分を標的とする一般に入手可能な突然変異およびRNAiラインに加えて、完全なゲノム配列を有する205の近交系野生由来株の集団であるショウジョウバエメラノガスター遺伝基準パネル(DGRP)の入手可能性は、ゲノム全体の関連研究9,1010を可能にした。9このような研究は、エタノール11、12,への発達暴露時の発達時間および生存可能性への影響に関連する遺伝的ネットワークを同定した。基本的な生物学的プロセスの進化的な保全は、彼らの飛行の相手に人間の正射手を重ね合わせることによって翻訳推論を描くことを可能にする。
エタノールにさらされたハエは、姿勢制御8の喪失、沈下、及び耐性13、14、15,14の発達を含む、ヒトアルコール中毒に似た生理学的および行動的変化を15受ける。ショウジョウバエにおけるアルコール誘発性沈着は、インエブリオメーターを用いて定量することができる。,これらは、ハエが16、17、18を付けることができる斜めのメッシュパーティションを持つ122,17cmの長さの垂直ガラス柱です。少なくとも50個のハエのグループ(男女は別々に分析することができる)がカラムの上部に導入され、エタノール蒸気にさらされる。姿勢制御を失うハエは柱を通って落下し、1分間隔で収集されます。平均溶出時間は、アルコール中毒に対する感受性の尺度として機能する。ハエが最初の暴露から回復した後に2度目にアルコールにさらされると、平均溶,出時間13、15、19、2015,19のシフトから明らかなように、耐性を開発することができます。1320非,滑計アッセイは、アルコール沈め感受性および耐性12、13、14、21の発達に関連する遺伝子、遺伝的ネットワーク12,13、14および細胞経路の同定につながっているのに対し、アッセイは時間がかかり、低スループットであり、単一のハエにおけるアルコール感受性を測定するのに効果がない。21
精巧な不エブリオメーターのセットアップを必要としない代替エタノール沈積アッセイは、より便利な測定を可能にするが、スループットに依然として制限されており、一般的に個人21、22、23、24、25ではなくハエ群の分析21,22,23,24を25必要とする。単一のハエを評価すると、社会的行動に起因するグループ相互作用による交音効果の可能性を最小限に抑えることができます。ここでは、多数の単一ハエにおけるアルコール沈殿感度を評価するための、シンプルで低コストで高スループットのアッセイを提示します。
ここでは、ショウジョウバエメラノガスターにおけるエタノール暴露による沈殿時間を評価するための簡便で安価で高スループットな方法を提示する。グループ分析を必要とする多くの現在の方法とは異なり、このアッセイは、1人の人が8時間の作業期間内に〜2,000ハエの個々の沈め時間データを収集することを可能にします。私たちは、1人が約5分でセドレーション時間のために48ハエを獲得できることを発見しました。このままでは、約4時間で2,000ハエを獲得できますが、後で得点を行うことができます。私たちのアッセイでは、ほとんどのハエの沈め時間は、1mLのエタノールに曝露して5〜15分の範囲です。エタノールの濃度が低い、またはより少ない送達量は、より長い沈行時間をもたらす。
沈座時間を評価するための現在の方法では,、1人の個人,,,,,,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26の測定を容易に可能にすることなく、多数のハエをテストする必要があります。15,16,17,1825,26192021222324多くの電流鎮静および感受性アッセイは、エタノール暴露の結果としてハエの50%が鎮静される時点,であるST502222、23、24に依存する。23,24ハエのグループのST50を得ることがこのアッセイを開発するための主な動機ではなかったが、ビデオ録画は、個別にテストされたハエのグループのST50を確認し、任意の時点で所定の基準を満たすハエの割合(例えば、姿勢制御の喪失)を測定するために使用することができるので、現在の方法と比較してより高い有用性を示す。このようなビデオ分析には追加の時間が必要になることに注意してください。
現在の不安定計アッセイとは異なり、我々が記述する方法は、設定するための特殊なツールを必要とせず、共通の材料を使用して任意の実験室で行うことができます。この方法を用いて、我々は個々のハエのための信頼でき、一貫した沈めの時間を得ました。アッセイは、原則として、あらゆる揮発性物質への暴露の影響を評価するために拡張することができる。このアッセイはまた、他のハエ種を含む他の昆虫に対する揮発性物質の急性毒性の影響を測定するために適用することができる。個々の沈着時間データを使用して、DGRPなどの母集団内の表現型変動の程度を評価することができます。
小さな昆虫スクリーンメッシュを使用してエタノール溶液との直接接触を防ぎ、十分な量のエタノール蒸気を飛びに届けることを可能にしました。スクリーンメッシュの上に白いチーズクロスの層は、ハエと下の表面の間の視覚的なコントラストを提供し、ハエが画面メッシュに巻き込まれないようにし、姿勢制御の喪失のあいまいな決定につながる可能性があります。水と空気に多孔質である市販の膜は、一貫性のない結果を与え、エタノール蒸気に対して十分に浸透できなかった。ウェル内の飛び位置の結果としてエタノール暴露のばらつきを最小限に抑える均一に多孔質材料であるため、意図的に小さな昆虫スクリーンメッシュを使用しました。我々は、制御行動室、ハエに近い90%〜100%エタノールへのアクセス、均一なエタノール暴露を推奨するが、利用可能な材料に基づいて、このプロトコルに変更を加えることができます。
位置偏りを避けるために、細胞培養プレート内の飛び位置を複製間でランダム化する必要があります。このアッセイを複数日にわたって使用する必要があり、アッセイ結果に影響を与える可能性のある環境変動(例えば、気圧の変化)27の大規模な実験では、ハエを毎日同じ時間にテストし、特に異なる線や性別を比較する場合は、毎日同じ時間にテストし、日中と日単位の両方で無作為化することを強くお勧めします。
我々が開発した方法は、急性アルコール暴露の効果を測定するのに最も適しているが、消費データやモデリング中毒を得るためには適していません。しかし、このアッセイから得られるアルコール沈着感度データは、アルコール関連表現型の他の尺度と統合することができる。システムの1つの制限は、標準的な細胞培養プレートの垂直高さは、全体的な活動または移動の詳細な評価のためにビデオでは容易に追跡することができない垂直フライの動きを可能にすることです。ただし、この制限は、セテーション時間の正確な評価には影響しません。異なる遺伝子型のハエ(例えば、DGRP由来の外れ集団28)を使用する場合、このアッセイはまた、バルクDNAシーケンシングおよび極端なQTLマッピング29、3030のための対照的な表現型を有するハエのプール29を収集するために個々のハエを検索することを可能にする。全体的に、このアッセイは、多数の単一ハエに関するアルコール沈下データの迅速で安価な収集を可能にする。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立衛生研究所からTFCMおよびRRHAへの助成金DA041613およびGM128974によって支えられた。
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |