تم تصميم الطرق الحالية لقياس حساسية الكحول في دروسوفيلا لاختبار مجموعات من الذباب. نحن نقدم بسيطة، منخفضة التكلفة، وعالية الإنتاجية قياس لتقييم حساسية حساسية التأنق الكحول في أعداد كبيرة من الذباب واحد. لا تتطلب الطريقة أدوات متخصصة ويمكن إجراؤها في أي مختبر باستخدام مواد مشتركة.
Drosophila melanogaster يوفر نموذجا ممتازا لدراسة الأسس الوراثية لحساسية الكحول. وعلى النقيض من الدراسات التي أجريت على السكان، يسمح نموذج دروسوفيلا بمراقبة صارمة على الخلفية الوراثية، ويمكن تربية أعداد غير محدودة تقريباً من الأفراد من نفس النمط الجيني بسرعة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة المشددة دون قيود تنظيمية وبتكلفة منخفضة نسبياً. يخضع الذباب المعرض للإيثانول لتغيرات فسيولوجية وسلوكية تشبه تسمم الكحول البشري ، بما في ذلك فقدان التحكم الوضعي ، والتخدير ، وتطوير التسامح. هنا ، نحن نصف بسيطة ، منخفضة التكلفة ، وعالية الإنتاجية قياس لتقييم حساسية حساسية التكبير في كمية كبيرة من الذباب واحد. ويستند هذا المنزى على تسجيل الفيديو من الذباب واحد أدخلت دون تخدير في لوحات ثقافة الخلية 24 بئر اعلى في مجموعة المتابعة التي تمكن من بدء متزامن من التعرض للكحول. ويمكّن النظام شخصاً واحداً من جمع بيانات فردية عن التأنّع الأيثانول على ما يصل إلى 2000 ذبابة خلال فترة عمل تبلغ 8 سات. ويمكن، من حيث المبدأ، توسيع نطاق الفحص لتقييم آثار التعرض لأي مادة متطايرة وتطبيقه لقياس آثار السمية الحادة للتطايرات على الحشرات الأخرى، بما في ذلك أنواع الذباب الأخرى.
ويفيد المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول أنه في عام 2015، أثر الإفراط في استهلاك الكحول، الذي تم تصنيفه على أنه “اضطراب تعاطي الكحول”، على ما يقدر بـ 16 مليون شخص في الولايات المتحدة. تعاطي الكحول يسبب مجموعة واسعة من الآثار الفسيولوجية السلبية وهو سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة. في البشر ، وانخفاض الحساسية ، أو انخفاض مستوى الاستجابة للكحول ، لديه مكون وراثي قوي ويرتبط بارتفاع خطر الإصابة باضطرابات تعاطي الكحول1،2،3،4. إن دراسات المخاطر الوراثية على السكان تشكل تحدياً بسبب خليط السكان، وتنوع تاريخ النمو والتعرض البيئي، والاعتماد على الاستبيانات المبلغ عنها ذاتياً لتحديد الأنماط الظاهرية المرتبطة بالكحول، والتي غالباً ما تكون مُخلطة مع حالات عصبية نفسية أخرى.
Drosophila melanogaster يوفر نموذجا ممتازا لدراسة الأسس الوراثية للحساسية الكحول5,6,7,8. يسمح نموذج Drosophila بمراقبة صارمة على الخلفية الوراثية ، ويمكن تربية أعداد غير محدودة تقريبًا من الأفراد من نفس النمط الجيني بسرعة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة بشكل جيد دون قيود تنظيمية وبتكلفة منخفضة نسبيًا. بالإضافة إلى الطفرات المتاحة للجمهور وخطوط RNAI التي تستهدف غالبية الجينات في الجينوم ، فإن توافر لوحة المراجع الوراثية Drosophila melanogaster (DGRP) ، وهي مجموعة من 205 خطوط مشتقة من البرية مع تسلسل الجينوم الكامل ، قد مكنت دراسات الارتباط على نطاق الجينوم9،10. وقد حددت هذه الدراسات الشبكات الوراثية المرتبطة بالآثار على وقت التنمية والجدوى عند التعرض التنموي للإيثانول11,12. الحفظ التطوري للعمليات البيولوجية الأساسية تمكن الاستدلالات الانتقالية يمكن استخلاصها عن طريق فرض تقويم العظام البشري على نظرائهم ذبابة.
الذباب المعرض للإيثانول يخضع لتغيرات فسيولوجية وسلوكية تشبه تسمم الكحول البشري ، بما في ذلك فقدان السيطرة الوضعية8، التخدير ، وتطوير التسامح13،14،15. يمكن قياس التأنيب الناجم عن الكحول في دروسوفيلا كميًا باستخدام مقاييس inebriometers. هذه هي أعمدة زجاجية عمودية طولها 122 سم مع أقسام شبكية مائلة يمكن أن نعلق عليها الذباب16،17،18. يتم إدخال مجموعة من ما لا يقل عن 50 ذبابة (يمكن تحليل الجنس بشكل منفصل) في الجزء العلوي من العمود وتعرضها لأبخرة الإيثانول. الذباب الذي يفقد السيطرة الوضعية تقع من خلال العمود ويتم جمعها على فترات 1 دقيقة. يعني وقت elution بمثابة مقياس للحساسية لتسمم الكحول. عندما يتعرض الذباب للكحول للمرة الثانية بعد التعافي من التعرض الأول ، فإنها يمكن أن تتطور التسامح ، كما يتضح من التحول في متوسط زمن الإلوتيون13،15،19،20. في حين أن المقالات inebriometer أدت إلى تحديد الجينات والشبكات الوراثية والمسارات الخلوية المرتبطة بحساسية حساسية التأنق الكحولي وتطور التسامح12،13،14،21، فإن الفحص يستغرق وقتًا طويلاً ، ومنخفض الإنتاجية ، وغير فعال لقياس حساسية الكحول في الذباب الواحد.
الاختبارات البديلة لجرعات الايثانول التي لا تتطلب إعداد مقياس inebriometer تفصيلا تسمح لقياسات أكثر ملاءمة ولكن لا تزال محدودة في الإنتاجية وتتطلب عموما تحليلات لمجموعات من الذباب بدلا من الأفراد21,22,23,24,25.25 إن تقييم الذباب الواحد يقلل من احتمال حدوث تأثيرات محيرة بسبب التفاعلات الجماعية، مثل تلك الناجمة عن السلوكيات الاجتماعية. هنا ، نقدم فحصًا بسيطًا ومنخفض التكلفة وعالي الإنتاجية لتقييم حساسية حساسية تناول الكحول في أعداد كبيرة من الذباب الواحد.
هنا، ونحن نقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة، وارتفاع الإنتاجية لتقييم وقت التأنق بسبب التعرض الإيثانول في drosophila melanogaster. على عكس العديد من الطرق الحالية ، والتي تتطلب تحليلات جماعية ، فإن هذا القول يمكّن شخصًا واحدًا من جمع بيانات وقت التأنق الفردية لـ ~ 2000 ذباب خلال فترة عمل 8 ساعة. وجدنا أن الشخص الواحد يمكن أن يسجل 48 ذبابة لوقت التأنق في حوالي 5 دقيقة. على هذا المعدل، يمكن تسجيل 2000 ذبابة في حوالي 4 ساعات، على الرغم من أن التهديف يمكن أن يتم في وقت لاحق. مع ازمنا، يتراوح وقت التأنق المسجل لمعظم الذباب من 5-15 دقيقة عند التعرض إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. وسيؤدي انخفاض تركيزات الإيثانول أو أحجام التسليم الأصغر إلى فترات أطول للتكبير.
تتطلب الطرق الحالية لتقييم وقت الرضاعة اختبار أعداد كبيرة من الذباب دون تمكين القياسات بسهولة على الأفراد العازبين15،16،17،18،19،20، 21،,22،23،24،25،26.2126 تعتمد العديد من المقالات الحالية للتأنس والحساسية على ST5022،23،24، النقطة الزمنية التي يتم فيها تكبير 50٪ من الذباب نتيجة التعرض للإيثانول. على الرغم من أن الحصول على ST50 لمجموعات من الذباب لم يكن الدافع الرئيسي لتطوير هذا الفحص ، فإن تسجيلات الفيديو تظهر فائدة أعلى مقارنة بالأساليب الحالية ، حيث يمكن استخدام التسجيلات للتأكد من ST50 لمجموعات الذباب المختبر ة بشكل فردي وقياس النسبة المئوية للذباب التي تفي بمعيار معين (على سبيل المثال ، فقدان التحكم الوضعي) في أي وقت. وتجدر الإشارة إلى أن تحليلات الفيديو هذه ستتطلب وقتا إضافيا.
على عكس المقالات الحالية لمفعل يُقدر، فإن الطريقة التي نصفها لا تتطلب أدوات متخصصة لإعدادها ويمكن إجراؤها في أي مختبر باستخدام مواد شائعة. باستخدام هذه الطريقة، حصلنا على أوقات تكبير موثوقة ومتسقة للذباب الفردية. ويمكن، من حيث المبدأ، توسيع نطاق الفحص لتقييم آثار التعرض لأي مادة متطايرة. ويمكن أيضا تطبيق الفحص لقياس آثار السمية الحادة للتطايرات على الحشرات الأخرى، بما في ذلك أنواع الذباب الأخرى. ويمكن استخدام بيانات وقت التأنيب الفردية لتقييم مدى التباين الفينوتيبي بين السكان، مثل DGRP.
استخدمنا شبكة شاشة الحشرات الصغيرة لمنع الاتصال المباشر مع محلول الإيثانول مع السماح بكميات كافية من أبخرة الإيثانول للوصول إلى الذبابة. توفر طبقة قماش الجبن الأبيض أعلى شبكة الشاشة تباينًا بصريًا بين الذبابة والسطح أدناه وتضمن عدم القبض على الذباب في شبكة الشاشة ، مما قد يؤدي إلى تحديد غامض لفقدان التحكم الوضعي. أعطت الأغشية المتاحة تجاريًا التي يتم اختراقها في الماء والهواء نتائج غير متسقة وكانت غير قابلة للاختراق بشكل كاف ٍ لأبخرة الإيثانول. استخدمنا عمدا شبكة شاشة الحشرات الصغيرة لأنها مادة مسامية بشكل موحد تقلل من الاختلاف في التعرض للإيثانول نتيجة لموقع الذبابة داخل البئر. يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول استنادًا إلى المواد المتاحة ، على الرغم من أننا نوصي بغرفة سلوكية خاضعة للرقابة ، والوصول إلى 90٪ – 100٪ إيثانول قريب من الذبابة ، والتعرض الموحد للإيثانول.
يجب أن يكون موضع الطيران داخل لوحات ثقافة الخلية معشاً بين النسخ المتماثل لتجنب التحيز الموضعي. بالنسبة للتجارب الأكبر التي تتطلب استخدام هذا الفحص عبر عدة أيام وبالتالي تخضع للتباين البيئي الذي يمكن أن يؤثر على نتائج الفحص (على سبيل المثال، التغيرات في الضغط البارومتري)27، نوصي بشدة باختبار الذباب في نفس الوقت كل يوم وعشوائية داخل وعبر الأيام ، خاصة إذا كانت الخطوط المختلفة و / أو الجنس يجب مقارنتها ببعضها البعض.
الطريقة التي طورناها هي الأنسب لقياس تأثير التعرض الحاد للكحول ولكنها ليست مناسبة للحصول على بيانات الاستهلاك أو إدمان النمذجة. ومع ذلك، يمكن دمج بيانات حساسية التأنق الكحولي التي تم الحصول عليها من هذا الفحص مع مقاييس أخرى للأنماط الظاهرية المرتبطة بالكحول. أحد قيود النظام هو أن الارتفاع الرأسي للوحات ثقافة الخلايا القياسية يسمح بحركة الطيران الرأسية التي لا يمكن تتبعها بسهولة عن طريق الفيديو لإجراء تقييم مفصل للنشاط العام أو الحركة. ومع ذلك، لا يؤثر هذا القيد على التقييم الدقيق لوقت التأنيب. عند استخدام الذباب من أنواع جينية مختلفة (على سبيل المثال، في المجموعات السكانية الأصيلة المشتقة من DGRP28)،تمكن هذه الإمكانية أيضًا من استرجاع الذباب الفردي لجمع برك من الذباب مع أنماط ظاهرية متناقضة لتسلسل الحمض النووي السائب ورسم خرائط QTL القصوى29،30. وعموما، يسمح هذا القول بجمع سريع وغير مكلف لبيانات تعاطي الكحول على أعداد كبيرة من الذباب الواحد.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل من خلال المنح DA041613 وGM128974 من المعاهد الوطنية للصحة إلى TFCM وRRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |