Les méthodes actuelles pour mesurer la sensibilité à l’alcool à Drosophila sont conçues pour tester des groupes de mouches. Nous présentons un simple, faible coût, l’essai à haut débit pour évaluer la sensibilité à la sédation de l’alcool dans un grand nombre de mouches simples. La méthode ne nécessite pas d’outils spécialisés et peut être effectuée en laboratoire à l’aide de matériaux communs.
Drosophila melanogaster fournit un excellent modèle pour étudier les fondements génétiques de la sensibilité à l’alcool. Contrairement aux études menées dans les populations humaines, le modèle Drosophila permet un contrôle strict sur le contexte génétique, et un nombre pratiquement illimité d’individus d’un même génotype peuvent être élevés rapidement dans des conditions environnementales bien contrôlées sans restrictions réglementaires et à un coût relativement faible. Les mouches exposées à l’éthanol subissent des changements physiologiques et comportementaux qui ressemblent à l’intoxication humaine à l’alcool, y compris la perte de contrôle postural, la sédation et le développement de la tolérance. Ici, nous décrivons un simple, faible coût, à haut débit d’essai pour évaluer la sensibilité à la sédation de l’alcool dans un grand nombre de mouches simples. L’essai est basé sur l’enregistrement vidéo de mouches simples introduites sans anesthésie dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits dans une configuration qui permet l’initiation synchrone de l’exposition à l’alcool. Le système permet à une seule personne de recueillir des données individuelles de sédation de l’éthanol sur pas moins de 2 000 mouches au cours d’une période de travail de 8 h. L’essai peut, en principe, être étendu pour évaluer les effets de l’exposition à toute substance volatile et appliqué pour mesurer les effets de la toxicité aigue des substances volatiles sur d’autres insectes, y compris d’autres espèces de mouches.
Le National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism rapporte qu’en 2015, la consommation excessive d’alcool, désignée comme un « trouble de consommation d’alcool », a touché environ 16 millions de personnes aux États-Unis. L’abus d’alcool cause un large éventail d’effets physiologiques indésirables et est une cause majeure de décès aux États-Unis. Chez l’homme, une diminution de la sensibilité, ou un faible niveau de réponse à l’alcool, a une forte composante génétique et est associée à un risque plus élevé de développer des troubles de consommation d’alcool1,2,3,4. Les études sur les risques génétiques sur les populations humaines sont difficiles en raison de l’admixture de la population, des antécédents de développement divers et des expositions environnementales, et de la dépendance à l’égard des questionnaires autodéclarés pour quantifier les phénotypes liés à l’alcool, qui sont souvent confondus avec d’autres affections neuropsychiatriques.
Drosophila melanogaster fournit un excellent modèle pour étudier les fondements génétiques de la sensibilité à l’alcool5,6,7,8. Le modèle Drosophila permet un contrôle strict sur les antécédents génétiques, et un nombre pratiquement illimité d’individus du même génotype peuvent être élevés rapidement dans des conditions environnementales bien contrôlées sans restrictions réglementaires et à un coût relativement faible. En plus des mutations accessibles au public et des lignées d’ARNi qui ciblent la majorité des gènes du génome, la disponibilité du Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), une population de 205 lignées d’origine sauvage consanguines avec des séquences complètes du génome, a permis des études d’association à l’échelle du génome9,10. De telles études ont identifié des réseaux génétiques associés aux effets sur le temps de développement et la viabilité lors de l’exposition au développement à l’éthanol11,12. La conservation évolutive des processus biologiques fondamentaux permet de tirer des inférences translationnelles en superposant des orthologues humains sur leurs homologues à la mouche.
Les mouches exposées à l’éthanol subissent des changements physiologiques et comportementaux qui ressemblent à l’intoxication humaine à l’alcool, y compris la perte de contrôle postural8, la sédation et le développement de la tolérance13,14,15. La sédation induite par l’alcool dans Drosophila peut être quantifiée à l’aide d’inebriomètres. Ce sont 122 cm de long colonnes de verre vertical avec cloisons en maille inclinées à laquelle les mouches peuvent attacher16,17,18. Un groupe d’au moins 50 mouches (les sexes peuvent être analysés séparément) sont introduits en haut de la colonne et exposés à des vapeurs d’éthanol. Les mouches qui perdent le contrôle postural tombent à travers la colonne et sont collectées à intervalles de 1 min. Le temps d’elution moyen sert de mesure de sensibilité à l’intoxication alcoolique. Lorsque les mouches sont exposées à l’alcool une deuxième fois après avoir récupéré de la première exposition, ils peuvent développer une tolérance, comme évident d’un changement dans le temps d’elution moyenne13,15,19,20. Alors que les essais d’inesbriomètre ont conduit à l’identification des gènes, des réseaux génétiques et des voies cellulaires associés à la sensibilité à la sédation de l’alcool et au développement de la tolérance12,13,14,21, l’essai prend du temps, faible débit, et inefficace pour mesurer la sensibilité à l’alcool chez les mouches simples.
Les essais alternatifs de sédation de l’éthanol qui ne nécessitent pas la mise en place d’inesbriomètre élaboré permettent des mesures plus pratiques mais sont encore limités dans le débit et exigent généralement des analyses de groupes de mouches plutôt que d’individus21,22,23,24,25. L’évaluation des mouches individuelles minimise le risque d’effets de confusion en raison des interactions de groupe, telles que celles découlant de comportements sociaux. Ici, nous présentons un simple, faible coût, à haut débit d’essai pour évaluer la sensibilité à la sédation de l’alcool dans un grand nombre de mouches simples.
Ici, nous présentons une méthode simple, peu coûteuse, et à haut débit pour évaluer le temps de sédation dû à l’exposition à l’éthanol dans Drosophila melanogaster. Contrairement à de nombreuses méthodes actuelles, qui nécessitent des analyses de groupe, cet essai permet à une seule personne de recueillir des données individuelles sur le temps de sédation pour 2 000 mouches dans une période de travail de 8 h. Nous avons constaté qu’une seule personne peut marquer 48 mouches pour le temps de sédation en environ 5 minutes. À ce rythme, 2 000 mouches peuvent être notées en environ 4 h, bien que la notation puisse être effectuée plus tard. Avec notre essai, le temps de sédation enregistré pour la plupart des mouches varie de 5 à 15 min à une exposition à 1 ml d’éthanol de 100 %. Des concentrations plus faibles d’éthanol ou de volumes de livraison plus faibles entraîneront des temps de sédation plus longs.
Les méthodes actuelles d’évaluation du temps de sédation nécessitent de tester un grand nombre de mouches sans permettre facilement des mesures sur les individusindividuels 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Beaucoup de sédation et d’analyses de sensibilité actuelles reposent sur ST5022,23,24, le point de temps auquel 50% des mouches sont sous sédatifs à la suite de l’exposition à l’éthanol. Bien que l’obtention du ST50 pour les groupes de mouches n’ait pas été la principale motivation pour développer cet essai, les enregistrements vidéo démontrent une utilité plus élevée par rapport aux méthodes actuelles, car les enregistrements peuvent être utilisés pour déterminer le ST50 pour les groupes de mouches testées individuellement et pour mesurer le pourcentage de mouches qui satisfont à un critère donné (p. ex., perte de contrôle postural) à tout moment. Il convient de noter que de telles analyses vidéo nécessiteraient plus de temps.
Contrairement aux essais actuels d’inesbriomètre, la méthode que nous décrivons ne nécessite pas d’outils spécialisés pour être mis en place et peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire à l’aide de matériaux communs. En utilisant cette méthode, nous avons obtenu des temps de sédation fiables et cohérents pour les mouches individuelles. L’essai peut, en principe, être étendu pour évaluer les effets de l’exposition à toute substance volatile. L’essai peut également être appliqué pour mesurer les effets de la toxicité aigue des substances volatiles sur d’autres insectes, y compris d’autres espèces de mouches. Les données individuelles sur le temps de sédation peuvent être utilisées pour évaluer l’étendue de la variation phénotypique au sein d’une population, comme la DGRP.
Nous avons utilisé de petits moustailles d’écran d’insecte pour empêcher le contact direct avec la solution d’éthanol tout en permettant des quantités suffisantes de vapeurs d’éthanol pour atteindre la mouche. La couche de tissu à fromage blanc sur le dessus de la maille d’écran fournit un contraste visuel entre la mouche et la surface ci-dessous et garantit que les mouches ne sont pas pris dans le maillage d’écran, ce qui pourrait conduire à une détermination ambigue de la perte de contrôle postural. Les membranes disponibles dans le commerce qui sont poreuses pour l’eau et l’air ont donné des résultats incohérents et étaient insuffisamment pénétensibles aux vapeurs d’éthanol. Nous avons intentionnellement utilisé de petits maillages d’écran d’insecte parce qu’il s’agit d’un matériau uniformément poreux qui minimise la variation de l’exposition à l’éthanol en raison de la position de mouche dans un puits. Des modifications peuvent être apportées à ce protocole en fonction des matériaux disponibles, bien que nous recommandons une chambre comportementale contrôlée, l’accès à 90 % à 100 % d’éthanol près de la mouche, et une exposition uniforme à l’éthanol.
La position de mouche dans les plaques de culture cellulaire doit être randomisée entre les répliques pour éviter le biais positionnel. Pour les expériences plus grandes qui nécessitent l’utilisation de cet essai sur plusieurs jours et sont donc soumis à des variations environnementales qui pourraient influencer les résultats d’analyse (par exemple, les changements de pression barométrique)27, nous recommandons fortement que les mouches soient testées à la même heure chaque jour et randomisées à la fois en quelques jours, surtout si différentes lignes et /ou sexes doivent être comparés les uns aux autres.
La méthode que nous avons mise au point est la mieux adaptée pour mesurer l’effet de l’exposition aigue à l’alcool, mais elle n’est pas adaptée à l’obtention de données sur la consommation ou à la modélisation de la dépendance. Les données sur la sensibilité à la sédation de l’alcool obtenues à partir de cet essai peuvent cependant être intégrées à d’autres mesures des phénotypes liés à l’alcool. Une limitation du système est que la hauteur verticale des plaques de culture cellulaire standard permet un mouvement vertical de mouche qui ne peut pas être facilement suivi par vidéo pour une évaluation détaillée de l’activité globale ou de la locomotion. Toutefois, cette limitation n’affecte pas l’évaluation précise du temps de sédation. Lors de l’utilisation de mouches de différents génotypes (par exemple, dans les populations de race dérivée de la DGRP28), cet essai permet également la récupération de mouches individuelles pour recueillir des bassins de mouches avec des phénotypes contrastés pour le séquençage de l’ADN en vrac et la cartographie QTL extrême29,30. Dans l’ensemble, cet essai permet une collecte rapide et peu coûteuse de données sur la sédation de l’alcool sur un grand nombre de mouches individuelles.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions DA041613 et GM128974 des National Institutes of Health au TFCM et à la RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |