Summary

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Abstract

İnsan bağırsak mikroorganizmaları son zamanlarda insan sağlığını teşvik ve hastalıkları önlemede araştırma önemli bir hedef haline gelmiştir. Sonuç olarak, endobiyotikler (örneğin, ilaçlar ve prebiyotikler) ve bağırsak mikrobiyotaları arasındaki etkileşimlerin araştırılması önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Ancak, insan gönüllüleri ile in vivo deneyler biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle bu tür çalışmalar için ideal değildir. Sonuç olarak, hayvan modelleri in vivo bu etkileşimleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, hayvan modeli çalışmaları hala biyoetik hususlar ile sınırlıdır, hayvanlarda farklı kompozisyonlar ve hayvanlarda mikrobiyota çeşitlemeleri ek olarak insanlara karşı. Alternatif bir araştırma stratejisi endobiyotikler ve in vitro bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesi sağlayan toplu fermantasyon deneyleri kullanımıdır. Bu stratejiyi değerlendirmek için bifidobakteriyel (Bif) eksopolisakkaritler (EPS) temsili ksenobiyotik olarak kullanıldı. Daha sonra, Bif EPS ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimler ince tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma lı analiz ve gaz kromatografisi gibi çeşitli yöntemlerle incelenmiştir. kısa zincirli yağ asitleri (SCFAs). Burada sunulan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür. Daha da önemlisi, bu protokol aynı zamanda diğer endobiyotikler ve bağırsak mikrobiyotaarasındaki genel etkileşimleri araştırmak için değiştirilebilir.

Introduction

Gut mikrobiyota insan bağırsaklarının işleyişinde ve konak sağlığında önemli bir rol oynamaktadır. Sonuç olarak, bağırsak mikrobiyota son zamanlarda hastalık önlemeve tedavi için önemli bir hedef haline gelmiştir 1. Ayrıca, bağırsak bakterileri konak bağırsak hücreleri ile etkileşim ve metabolik faaliyetler, besin kullanılabilirlik, bağışıklık sistemi modülasyonu ve hatta beyin fonksiyonu ve karar verme dahil olmak üzere temel konak süreçlerini düzenleyen2,3 . Endobiyotikler bakteri bileşimi ve bağırsak mikrobiyota çeşitliliği etkilemek için önemli bir potansiyele sahip. Böylece, endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimler artan araştırma dikkat çekti4,5,6,7,8,9.

Biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası in vivo arasındaki etkileşimleri değerlendirmek zordur. Örneğin, endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri araştıran deneyler Gıda ve İlaç İdaresi izni olmadan yapılamaz, ve gönüllü alımı pahalıdır. Sonuç olarak, hayvan modelleri genellikle bu tür araştırmalar için kullanılır. Ancak, hayvan modellerinin kullanımı farklı mikrobiyota kompozisyonları ve hayvan-vs insan ilişkili topluluklarda çeşitlilik nedeniyle sınırlıdır. Alternatif in vitro yöntemi endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimleri keşfetmek için toplu kültür deneyleri kullanımı ile.

Eksopolisakkaritler (EPSs) önemli ölçüde insan sağlığının bakımına katkıda prebiyotikler10. Farklı monosakkarit bileşimlerinden ve yapılarından oluşan farklı EPS’ler farklı işlevler sergileyebilir. Daha önceki analizler, mevcut çalışmada hedeflenen temsili ksenobiyotik olan Bif EPSs’nin bileşimini belirlemiştir11. Ancak, konakilişkili metabolik etkileri EPS bileşimi ve çeşitliliği açısından dikkate alınmamıştır.

Burada açıklanan protokol bif EPSs fermantasyon için 12 gönüllü gelen dışkı mikrobiyota kullanır. İnce tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma alanı sıralaması ve gaz kromatografisi (GC) eps ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri araştırmak için birlikte kullanılır. Bu protokolün in vivo deneylere göre belirgin avantajları düşük maliyetli ve konak metabolizmasından kaynaklanan etkilerden kaçınmadır. Ayrıca, açıklanan protokol endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotaarasındaki etkileşimleri araştırmak diğer çalışmalarda kullanılabilir.

Protocol

Bu protokol, Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi (Hunan, Çin) ve Zhejiang Gongshang Üniversitesi (Zhejiang, Çin) etik komitesinin yönergelerini izler. 1. Bakterilerin hazırlanması Bifidobacterium orta et suyu hazırlanması Aşağıdaki bileşenleri 950 mL distile suda birleştirin: et özü, 5 g/L; maya özü, 5 g/L; kazein peptone, 10 g/L; soya tonulu, 5 g/L; glikoz, 10 g/L; K2HPO4, 2.04 g/L; MgSO4·7H2O, 0.22 g/L; MnS…

Representative Results

Mukoid EPS üretimi 72 saat anaerobik kuluçka dan sonra PYG plakaları üzerinde B. longum kültürlerde görülebilir (Şekil1A). Kültür kazımalarının santrifüjü, ardından etanol çökeltme ve kuruma, selüloz benzeri EPS toplanması ile sonuçlanır (Şekil 1B). Kurutulmuş EPS ve çözünür nişasta daha sonra fermantasyon kültürleri için karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. TLC oligosakkarit ayırma ve saflık analizi nedeniyle d…

Discussion

Son on yılda insan bağırsak mikrobiyota bileşimi ve faaliyetleri anlama yolunda önemli ilerleme yapılmıştır. Bu çalışmaların bir sonucu olarak, holobiont kavramı ortaya çıkmıştır, hangi konaklar ve ilişkili mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimleri temsil eden, insanlar ve bağırsak mikrobiyota arasında olduğu gibi19,20. Ayrıca, insanlar bile şimdi süperorganizmalar21olarak kabul edilir , bağırsak mikrob…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31741109), Hunan Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2018JJ3200) ve Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi’nde uygulamalı karakteristik disiplinin yapı programı tarafından finanse edilmiştir. LetPub’a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanmasısırasındaki dilsel yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

View Video