Summary

Analyse van interacties tussen Endobiotica en humane gut microbiota met behulp van in-vitro Bad fermentatiesystemen

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Hier beschreven is een protocol om de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota met behulp van in vitro batch fermentatiesystemen te onderzoeken.

Abstract

Menselijke intestinale micro-organismen zijn onlangs uitgegroeid tot een belangrijk doelwit van onderzoek bij het bevorderen van de menselijke gezondheid en het voorkomen van ziekten. Bijgevolg zijn onderzoeken naar interacties tussen endobiotica (bijv. drugs en prebiotica) en gut microbiota een belangrijk onderzoeksonderwerp geworden. In vivo experimenten met menselijke vrijwilligers zijn echter niet ideaal voor dergelijke studies als gevolg van bio-ethiek en economische beperkingen. Als gevolg hiervan zijn diermodellen gebruikt om deze interacties in vivo te evalueren. Niettemin, diermodel studies zijn nog steeds beperkt door bio-ethiek overwegingen, naast de verschillende samenstellingen en diversiteit van microbiota bij dieren vs. mensen. Een alternatieve onderzoeksstrategie is het gebruik van batch fermentatie-experimenten die het mogelijk maken de interacties tussen endobiotica en gut microbiota in vitro te evalueren. Om deze strategie te evalueren, werden bifidobacteriële (BIF) exopolysacchariden (EPS) gebruikt als representatief xenobioticum. Vervolgens werden de interacties tussen BIF EPS en humane gut microbiota onderzocht met behulp van verschillende methoden zoals Thin-layer chromatografie (TLC), bacteriële compositorische analyse met 16S rRNA Gene High-throughput sequencing en gaschromatografie van korte-keten vetzuren (SCFAs). Hier gepresenteerd is een protocol om de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota met behulp van in vitro batch fermentatiesystemen te onderzoeken. Belangrijk is dat dit protocol ook kan worden aangepast om de algemene interacties tussen andere endobiotica en gut microbiota te onderzoeken.

Introduction

Gut microbiota spelen een belangrijke rol in de werking van de menselijke darmen en in de gezondheid van de gastheer. Bijgevolg, gut microbiota zijn onlangs uitgegroeid tot een belangrijk doelwit voor ziektepreventie en therapie1. Bovendien, gut bacteriën interactie met gastheer intestinale cellen en reguleren fundamentele gastheer processen, met inbegrip van metabole activiteiten, voedingsstoffen availabiliteiten, immuun systeem modulatie, en zelfs hersenfunctie en besluitvorming van2,3 . Endobiotica hebben aanzienlijke potentie om invloed op de bacteriële samenstelling en de diversiteit van gut microbiota. Zo, interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota hebben aangetrokken toegenomen onderzoek aandacht4,5,6,7,8,9.

Het is moeilijk om de interacties tussen endobiotica en humane gut microbiota in vivo te evalueren als gevolg van bio-ethiek en economische beperkingen. Bijvoorbeeld, experimenten onderzoeken de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota kan niet worden uitgevoerd zonder toestemming van de Food and Drug Administration, en werving van vrijwilligers is duur. Daarom worden voor dergelijke onderzoeken vaak diermodellen gebruikt. Het gebruik van diermodellen is echter beperkt als gevolg van verschillende microbiota-composities en diversiteit in dier-vs. mensen-geassocieerde Gemeenschappen. Een alternatieve in vitro methode om de interacties tussen endobiotica en humane gut microbiota te onderzoeken is door het gebruik van batch cultuur experimenten.

Exopolysacchariden (EPSs) zijn prebiotica die significant bijdragen aan het behoud van de gezondheid van de mens10. Afzonderlijke EPSS die bestaan uit verschillende Monosacharide composities en structuren kunnen verschillende functies vertonen. Eerdere analyses hebben de samenstelling van BIF EPSs bepaald, de representatieve xenobiotische die in de huidige studie11is getarget. Echter, gastheer-geassocieerde metabole effecten zijn niet overwogen met betrekking tot EPS samenstelling en diversiteit.

Het hier beschreven protocol gebruikt de fecale microbiota van 12 vrijwilligers tot gisten BIF EPSS. Thin-layer chromatografie (TLC), 16S rRNA Gene High-throughput sequencing en gaschromatografie (GC) worden vervolgens gebruikt in combinatie om de interacties tussen EPSs en humane gut microbiota te onderzoeken. Duidelijke voordelen van dit protocol in vergelijking met in vivo experimenten zijn de lage kosten en het vermijden van storende effecten van de stofwisseling van de gastheer. Bovendien kan het beschreven protocol worden gebruikt in andere onderzoeken die interacties tussen endobiotica en humane gut microbiota onderzoeken.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie van Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) en de Zhejiang Gongshang-Universiteit (Zhejiang, China). 1. bereiding van bacteriën Voorbereiding van Bifidobacterium medium Bouillon Combineer de volgende componenten in 950 mL gedistilleerd water: vleesextract, 5 g/L; Gistextract, 5 g/L; caseïne peptone, 10 g/L; soja Toon, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4</sub…

Representative Results

De productie van mucoïde EPS kan worden waargenomen in B. longum culturen op pyg platen na anaerobe incubatie voor 72 h (Figuur 1a). Centrifugeren van cultuur resten, gevolgd door ethanol precipitatie en drogen, resulteerde in de inzameling van cellulose-achtige EPS (Figuur 1b). Gedroogde EPS en oplosbare zetmeel werden vervolgens gebruikt als koolstofbronnen voor fermentatie culturen. TLC werd gebruikt voor oligosaccharide scheiding en zuiverheid anal…

Discussion

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van de samenstelling en activiteiten van menselijke gut microbiota in het afgelopen decennium. Als gevolg van deze studies is het concept van holobiont ontstaan, dat de interacties tussen hosts en geassocieerde microbiële gemeenschappen vertegenwoordigt, zoals tussen mensen en hun gut microbiota19,20. Bovendien, mensen worden nu zelfs beschouwd als Super organismen21, waarbij de darm mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd gefinancierd door de National Nature Science Foundation of China (nr. 31741109), de Hunan Natural Science Foundation (nr. 2018JJ3200), en het construct programma van toegepaste karakteristieke discipline in de Hunan University of Science and Engineering. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

View Video