Summary

تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

يوصف هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر.

Abstract

وقد أصبحت الكائنات الحية الدقيقة المعوية البشرية في الآونة الأخيرة هدفا هاما للبحوث في مجال تعزيز صحة الإنسان والوقاية من الأمراض. وبالتالي، أصبحت التحقيقات في التفاعلات بين الاندوبايوتكس (مثل الأدوية والبريبايوتكس) وميكروبيوتا الأمعاء موضوعا ً بحثيًا مهمًا. ومع ذلك، في التجارب الحية مع المتطوعين الإنسان ليست مثالية لمثل هذه الدراسات بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. ونتيجة لذلك، تم استخدام النماذج الحيوانية لتقييم هذه التفاعلات في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال الدراسات النموذجية الحيوانية محدودة باعتبارات أخلاقيات البيولوجيا، بالإضافة إلى اختلاف التراكيب والتنوعات في الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات مقابل البشر. استراتيجية بحثية بديلة هي استخدام تجارب التخمير الدفعية التي تسمح بتقييم التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء في المختبر. لتقييم هذه الاستراتيجية، تم استخدام ثنائي ة البكتيريا (بيف) اكسوبوليساكاريدس (EPS) كممثل xenobiotic. ثم، تم التحقيق في التفاعلات بين Eps BIF وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام عدة طرق مثل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC)، والتحليل التركيبي المجتمعي البكتيري مع تسلسل الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية من الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). يقدم هنا بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر. والأهم من ذلك، يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول للتحقيق في التفاعلات العامة بين بطانة الرحم الأخرى وميكروبيوتا الأمعاء.

Introduction

تلعب الكائنات المجهرية في الأمعاء دورًا هامًا في أداء الأمعاء البشرية وفي صحة المضيف. وبالتالي، أصبحت ميكروبيوتا الأمعاء مؤخرا هدفا هاما للوقاية من الأمراض والعلاج1. وعلاوة على ذلك، تتفاعل بكتيريا الأمعاء مع الخلايا المعوية المضيفة وتنظم العمليات الأساسية المضيفة، بما فيذلك الأنشطة الأيضية، وتوافر المواد الغذائية، وتعديل الجهاز المناعي، وحتى وظيفة الدماغ وصنع القرار 2،3 . إن بطانة الرحم لديها إمكانات كبيرة للتأثير على التركيب البكتيري وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء. وهكذا، جذبت التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتاالأمعاء البشرية زيادة الاهتمام البحثي 4،9.

من الصعب تقييم التفاعلات بين الانبوبيوتكس وميكروبيوتا الأمعاء البشرية في الجسم الحي بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. على سبيل المثال، لا يمكن إجراء التجارب التي تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية دون إذن من إدارة الغذاء والدواء، وتوظيف المتطوعين مكلف. وبالتالي، كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية لمثل هذه التحقيقات. ومع ذلك، فإن استخدام النماذج الحيوانية محدود بسبب اختلاف التراكيب المجهرية والتنوع في المجتمعات الحيوانية مقابل المجتمعات المرتبطة بالإنسان. وهناك طريقة بديلة في المختبر لاستكشاف التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية من خلال استخدام تجارب الثقافة دفعة.

إكسوبوليساكاريدس (EPSS) هي البريبايوتكس التي تسهم بشكل كبير في الحفاظ على صحة الإنسان10. يمكن أن تظهر EPSs المتميزة التي تتكون من تركيبات وهياكل أحادية السكريات وظائف متميزة. وقد حددت التحليلات السابقة تكوين BIF EPSs، والتي هي xenobiotic ممثل المستهدفة في الدراسة الحالية11. ومع ذلك، لم يتم النظر في الآثار الأيضية المرتبطة بالمضيف فيما يتعلق بتكوين EPS والتنوع.

يستخدم البروتوكول الموضح هنا الميكروبيوتا البرازية من 12 متطوعًا لتخمير الـ Bif EPSs. ثم يتم استخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC)، وتسلسل الجينات ذات الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية (GC) في تركيبة للتحقيق في التفاعلات بين EPSs وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. مزايا متميزة من هذا البروتوكول بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي هي انخفاض تكلفته وتجنب آثار التدخل من التمثيل الغذائي للمضيف. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في دراسات أخرى تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في جامعة هونان للعلوم والهندسة (هونان، الصين)، وجامعة تشجيانغ غونغشانغ (تشجيانغ، الصين). 1. إعداد البكتيريا إعداد مرق ثنائي البكي المتوسط الجمع بين المكونات التالية في 950 مل من الماء المقطر: استخراج اللحوم، 5 غ…

Representative Results

ويمكن ملاحظة إنتاج EPS المخاطية في الثقافات B. longum على لوحات PYG بعد الحضانة اللاهوائية لمدة 72 ساعة (الشكل1A). المركزية من القصاصات الثقافة، تليها هطول الأمطار الإيثانول والتجفيف، أدى إلى جمع EPS مثل السليلوز (الشكل1B). ثم استخدمت EPS المجففة والنشا القابل للذو…

Discussion

وقد أحرز تقدم كبير نحو فهم تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية وأنشطتها على مدى العقد الماضي. ونتيجة لهذه الدراسات، ظهر مفهوم الهولوبيوت، الذي يمثل التفاعلات بين المضيفين والمجتمعات الميكروبية المرتبطة بها، كما هو الحال بين البشر وميكروبيوتا الأمعاء19،20. وع…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم 31741109)، ومؤسسة هونان للعلوم الطبيعية (رقم 2018JJ3200)، وبرنامج بناء الانضباط المميز التطبيقي في جامعة هونان للعلوم والهندسة. نشكر ليتبوب (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

View Video