체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석
Summary
여기서 설명된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다.
Abstract
인간의 장내 미생물은 최근 인간의 건강을 증진하고 질병을 예방하는 연구의 중요한 대상이되었습니다. 따라서, endobiotics 사이 상호 작용의 조사 (예를 들어, 마약과 prebiotics) 그리고 창 자 microbiota 중요 한 연구 주제가 되고있다. 그러나, 인간 자원 봉사자와 생체 내 실험은 생물 윤리 및 경제적 제약으로 인해 이러한 연구에 이상적이지 않습니다. 그 결과, 동물 모델은 생체 내에서 이러한 상호작용을 평가하는 데 사용되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델 연구는 여전히 생물 윤리 고려에 의해 제한 됩니다., 동물 대 인간에서 microbiota의 다른 조성및 다양 성 뿐만 아니라. 대체 연구 전략은 시험관내 내생생물학과 장내 미생물 간의 상호 작용을 평가할 수 있는 일괄 발효 실험의 사용입니다. 이러한 전략을 평가하기 위해, 비피도박테리아(Bif) 외다당류(EPS)를 대표적인 제노바이오틱으로 사용하였다. 그 후, Bif EPS와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은 16S rRNA 유전자고 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피와 같은 얇은 층 크로마토그래피(TLC), 세균 공동체 조성 분석과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 조사되었습니다. 짧은 사슬 지방산 (SCFA)의. 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다. 중요 한 것은, 이 프로토콜은 또한 다른 endobiotics와 창 자 microbiota 사이 일반적인 상호 작용을 조사 하기 위해 수정될 수 있습니다.
Introduction
창자 미생물은 인간의 창자 기능과 숙주 건강에 중요한 역할을 합니다. 따라서, 창자 미생물은 최근 질병 예방 및 치료1의중요한 표적이되었습니다. 또한, 창 자 박테리아 호스트 장 세포와 상호 작용 하 고 기본적인 호스트 프로세스를 조절, 신진 대사 활동을포함 하 여, 영양소 가용성, 면역 체계 변조, 심지어 뇌 기능 및 의사 결정 2,3 . Endobiotics 세균 성 구성 및 창 자 microbiota의 다양성에 영향을 미칠 상당한 잠재력을 가지고. 따라서, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은4,5,6,7,8,9.
생체 윤리 및 경제적 제약으로 인해 생체 내 내 생물 학 및 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용을 평가 하기 어렵다. 예를 들어, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 실험은 식품의약품안전청의 허가 없이는 수행할 수 없으며, 자원봉사자 모집은 비용이 많이 듭니다. 따라서 동물 모델은 종종 그러한 조사에 사용됩니다. 그러나, 동물 모델의 사용은 동물-대 인간 관련 지역 사회에서 상이한 미생물 조성물 및 다양성으로 인해 제한된다. 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 탐구하는 대안체외 방법은 배치 배양 실험을 통해서이다.
외다당류(EPS)는 인간의 건강 유지에 크게 기여하는 프리바이오틱스(EPS)(10)이다. 상이한 단당류 조성물 및 구조로 구성된 뚜렷한 EPS는 뚜렷한 기능을 나타낼 수 있다. 이전 분석은 Bif EPS의 조성을 결정하였는데, 이는 현재 연구11에서표적화된 대표적인 xenobiotic이다. 그러나, 호스트 관련 신진 대사 효과 EPS 조성 및 다양성에 관한 고려 되지 않은.
여기에 설명된 프로토콜은 12명의 자원봉사자들로부터 Bif EPS를 발효시키기 위해 배설물 미생물을 사용합니다. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 16S rRNA 유전자 높은 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피 (GC)는 EPS와 인간 장 내 미생물 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 조합하여 사용됩니다. 생체 내 실험에 비해이 프로토콜의 뚜렷한 장점은 그것의 낮은 비용과 호스트의 신진 대사에서 방해 효과의 회피. 또한, 설명된 프로토콜은 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 조사하는 다른 연구에서 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 10년 동안 인간의 장내 미생물 구성과 활동을 이해하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 이러한 연구의 결과로, 홀로비오온 개념은 인간과 그들의 창자 microbiota 사이와 같은 호스트와 관련미생물 군사회사이 상호 작용을 나타내는 19,20. 더욱이, 인간은 지금도 초고생물(21)으로 여겨지고 있으며, 여기서 장내 미생물은 인간22,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립자연과학재단(31741109호), 후난자연과학재단(2018JJ3200호), 후난대학교 과학공학부 에서 의뢰한 특성분야 조성 프로그램이다. 이 원고를 준비하는 동안 LetPub (www.letpub.com)의 언어 적 지원에 감사드립니다.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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