Summary

Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Описано здесь протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечника человека микробиоты с использованием in vitro пакетных систем брожения.

Abstract

Микроорганизмы кишечника человека в последнее время стали важной целью исследований в области укрепления здоровья человека и профилактики заболеваний. Следовательно, исследования взаимодействия между эндобиотиками (например, препаратами и пребиотиками) и микрофлорой кишечника стали важной темой исследования. Тем не менее, эксперименты in vivo с человеческими добровольцами не являются идеальными для таких исследований из-за биоэтики и экономических ограничений. В результате, животные модели были использованы для оценки этих взаимодействий in vivo. Тем не менее, исследования моделей на животных по-прежнему ограничены соображениями биоэтики, в дополнение к различным композициям и разнообразию микробиоты у животных по сравнению с людьми. Альтернативной стратегией исследования является использование пакетных экспериментов брожения, которые позволяют оценить взаимодействия между эндобиотиками и кишечной микробиотой in vitro. Для оценки этой стратегии, бифидобактерии (Bif) экзополисахариды (EPS) были использованы в качестве представителя ксенобиотик. Затем взаимодействия между Bif EPS и микрофлорой кишечника человека были исследованы с помощью нескольких методов, таких как тонкослойная хроматография (TLC), бактериальный композиционный анализ сообщества с 16S rRNA гена высокой пропускной способности секвенирования, и газовой хроматографии короткоцепочечных жирных кислот (СКФО). Представлен протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечной микрофлоры кишечника человека с использованием in vitro пакетных ферментации систем. Важно отметить, что этот протокол также может быть изменен для изучения общих взаимодействий между другими эндобиотиками и кишечной микробиотой.

Introduction

Микробиота кишки играет важную роль в функционировании кишечника человека и в здоровье хозяина. Следовательно, кишечная микробиота в последнее время стали важной мишенью для профилактики заболеваний и терапии1. Кроме того, кишечные бактерии взаимодействуют с клетками кишечника и регулируют фундаментальные процессы пребывания, включая метаболическую деятельность, наличие питательных веществ, модуляцию иммунной системы и даже функцию мозга и принятие решений2,3 . Эндобиотики обладают значительным потенциалом для влияния на бактериальный состав и разнообразие кишечной микробиоты. Таким образом, взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека привлекло все большее внимание к исследованиям4,5,6,7,8,9.

Трудно оценить взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека in vivo из-за биоэтики и экономических ограничений. Например, эксперименты, исследующие взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека, не могут быть проведены без разрешения Управления по контролю за продуктами и лекарствами, а набор добровольцев обходится дорого. Следовательно, животные модели часто используются для таких исследований. Тем не менее, использование моделей животных ограничено из-за различных композиций микробиоты и разнообразия в животных против человека связанных общин. Альтернативный метод in vitro для изучения взаимодействий между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека — это использование экспериментов по пакетной культуре.

Экзополисахариды (EPS) являются пребиотиками, которые вносят значительный вклад в поддержание здоровья человека10. Различные EPS, которые состоят из различных моносахаридных композиций и структур могут проявлять различные функции. Предыдущие анализы определили состав Bif EPSs, которые являются репрезентативными ксенобиотами, предназначенными в текущем исследовании11. Однако связанные с хост метаболическими эффектами не были учтены в отношении состава и разнообразия EPS.

В описанном здесь протоколе используется фекальная микробиота от 12 добровольцев для брожения Bif EPS. Тонкослойная хроматография (TLC), ген 16S rRNA высокой пропускной способности секвенирования, и газовая хроматография (ГК) затем используются в комбинации для исследования взаимодействий между ЭПС и микрофлоры кишечника человека. Отличительными преимуществами этого протокола по сравнению с экспериментами in vivo являются его низкая стоимость и избегание вмешательства в обмен веществ хозяина. Кроме того, описанный протокол может быть использован в других исследованиях, которые исследуют взаимодействия между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека.

Protocol

Этот протокол следует руководящим принципам комитета по этике Хунаньского университета науки и инженерии (Хунань, Китай) и Университета Чжэцзян Гуншань (Чжэцзян, Китай). 1. Подготовка бактерий Приготовление бифидобактерий среднего бульона Смешайте следующие к?…

Representative Results

Производство слизистой ОБОЛОЧКи может наблюдаться в B. longum культур на PYG пластин после анаэробной инкубации для 72 ч (рисунок1A). Центрифугация культуры царапин, а затем этанола осадков и высыхания, привело к сбору целлюлозы, как EPS (Рисунок 1B). Сушеные EPS…

Discussion

За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании состава и деятельности микрофлоры кишечника человека. Как следствие этих исследований, концепция голобиона возникла, которая представляет собой взаимодействие между хостом и связанных с ними микробных сообщес…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было профинансировано Национальным фондом естественных наук Китая (No 31741109), Фондом естественных наук Хунаня (No 2018JJ3200), а также программой строительства прикладной характерной дисциплины в Хунаньском университете науки и техники. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь в подготовке этой рукописи.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

View Video