Summary

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.

Abstract

Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.

Introduction

Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden1. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung2,3 . Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota zu beeinflussen. So, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota haben zunehmende Forschungsaufmerksamkeitangezogen 4,5,6,7,8,9.

Es ist schwierig, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota in vivo aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen zu bewerten. Zum Beispiel können Experimente, die die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen, nicht ohne Erlaubnis der Food and Drug Administration durchgeführt werden, und die Rekrutierung von Freiwilligen ist teuer. Daher werden für solche Untersuchungen häufig Tiermodelle verwendet. Die Verwendung von Tiermodellen ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Mikrobiotazusammensetzungen und Diversität in tier- und menschenverbundenen Gemeinschaften begrenzt. Eine alternative In-vitro-Methode zur Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota ist der Einsatz von Batch-Kulturexperimenten.

Exopolysaccharide (EPS) sind Präbiotika, die wesentlich zur Erhaltung der menschlichen Gesundheit beitragen10. Verschiedene EPS, die aus verschiedenen Monosaccharid-Zusammensetzungen und -Strukturen bestehen, können unterschiedliche Funktionen aufweisen. Frühere Analysen haben die Zusammensetzung der Bif EPS bestimmt, die das repräsentative Xenobiotikum sind, das in der aktuellen Studie11ins Visier genommen wird. Die wirtassoziierten metabolischen Effekte wurden jedoch hinsichtlich der EPS-Zusammensetzung und -Vielfalt nicht berücksichtigt.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die fäkale Mikrobiota von 12 Freiwilligen, um Bif EPS zu fermentieren. Die Dünnschichtchromatographie (TLC), die 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und die Gaschromatographie (GC) werden dann in Kombination verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen EPS und humaner Darmmikrobiota zu untersuchen. Deutliche Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu In-vivo-Experimenten sind seine niedrigen Kosten und die Vermeidung von störenden Effekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Darüber hinaus kann das beschriebene Protokoll in anderen Studien verwendet werden, die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) und der Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, China). 1. Herstellung von Bakterien Zubereitung von Bifidobacterium mittlerer Brühe Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Fleischextrakt, 5 g/L; Hefeextrakt, 5 g/L; Casein-Pepton, 10 g/L; Soytone, 5 g/L; Glukose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4…

Representative Results

Die Produktion von Schleimhaut EPS konnte in B. Longumkulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 h beobachtet werden (Abbildung 1A). Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS (Abbildung 1B). Getrocknetes EPS und lösliche Stärke wurden dann als Kohlenstoffquellen für Fermentationskulturen verwendet. TLC wurde für die Oligosaccharid-Trennung und Reinhe…

Discussion

In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota19,20. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31741109), der Hunan Natural Science Foundation (Nr. 2018JJ3200) und dem Konstruktprogramm der angewandten charakteristischen Disziplin an der Hunan University of Science and Engineering finanziert. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

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Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

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