Summary

Почечная субкапсулярная трансплантация 2'-Деоксигуанозин-обработанный Мурин Эмбриональный Тимус в обнаженных мышей

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Мы предоставляем простой и эффективный метод для трансплантации 2′-деоксигуанозин лечение E18.5 тимуса в почечной капсуле обнаженной мыши. Этот метод должен помощник в изучении как тимоэпилитических клеток функции и Т-клеток созревания.

Abstract

Тимус является важным центральным иммунным органом, который играет важную роль в развитии и дифференциации Т-клеток. Трансплантация тимуса является важным методом для исследования функции тимических эпителиальных клеток и созревания Т-клеток in vivo. Здесь мы опишите экспериментальные методы, используемые в нашей лаборатории для трансплантации 2′-деоксигуанозин (для истощения лимфоцитов донора) лечение эмбрионального тимуса в почечную капсулу атимичной обнаженной мыши. Этот метод является простым и эффективным и не требует специальных навыков или устройств. Результаты, полученные с помощью этого простого метода показали, что пересаженный тимус может эффективно поддерживать производство Т-клеток реципиента. Кроме того, будут дополнительно прояснены некоторые ключевые моменты, касающиеся протокола.

Introduction

Тимус является центральным иммунным органом, в тимоцитах тимуса проходят положительныйи отрицательный отбор, и становятся зрелыми Т-клетками 1,2. Аномальный положительный или отрицательный отбор приводит киммунодефициту или аутоиммунным патологиям соответственно 3,4. Поэтому трансплантация органов тимуса является важным подходом к изучению процесса отбора Т-клеток в тимусе донора. Этот метод особенно важен при анализе тимической эпителиальной функции, опосредоченной геннымимутациями, которые вызывают эмбриональный смертельный фенотип при мутации 5.

Для изучения созревания Т-клеток реципиента в пересаженном тимусе необходимо истощение лимфоцитов донора в тимфоцитах. Для этой цели, эмбриональный 14-, 15- или 16-дневный (E14, E15,E16) тимуса обычно выбирается 6,7. Тимус из более зрелых стадий также может быть успешно истощены лимфоцитов донора путем лечения 2′-деоксигуанозина. Однако подробный протокол для истощения лимфоцитов и использования более старойкультуры тимуса ранее не был описан 8,9. В то время как протоколы трансплантации были введены несколькими исследованиями10,11, дальнейшее изменение и совершенствование этих протоколов необходимо.

Наш протокол разделен на две части: i) истощение Т-лимфоцитов от поздней стадии развития E18.5 thymus культурой в 2′-деоксигуанозин-содержащих средств массовой информации. ii) трансплантация культивированных тимуса получателям. В этой процедуре мы разработали простой способ доставки большой ткани (E18.5 thymus) в почечную капсулу с пониженной вероятностью травмы почек. Сосредоточившись на поздней стадии тимуса, наш протокол также может быть использован непосредственно или с модификациями для трансплантации тимуса на различных стадиях развития или других аналогичных размеров тканей.

Protocol

Представленный протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике Университета Цзинань в отношении ухода за животными. ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые материалы перечислены в таблице материалов. 1. Изоляция эмбрионального тимуса</…

Representative Results

Здесь мы покажем изолированные E18.5 тимуса, содержащие две полные доли(Рисунок 1). Кроме того, мы показываем иглы вены кожи головы, которая была обрезана, чтобы сформировать скобы на инфузионной трубке(рисунок 2). Далее мы также показываем репрезентативное ?…

Discussion

Почечная субкапсулулярная трансплантация эмбрионального тимуса является важным методом изучения функции тимических эпителиальных клеток и процесса созревания Т-клеток в vivo. Хотя Есть несколько экспериментальных исследований по эмбриональной культуры органов тимуса и трансплантац…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана стартовым пакетом Университета Цзинаня в S.J. и Научно-технической программой Гуанчжоу Китая (Грант No 2017040209 в S.J.). Мы благодарим Эми Ботту (Департамент биологии, йоркский университет, Торонто, ON M3J 1P3, Канада) за коррективы и редактирование рукописи.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

References

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
  2. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
  3. Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
  4. Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
  5. Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
  6. Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
  7. Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
  8. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  9. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  10. Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
  11. Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
  12. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
  13. Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
  14. Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

View Video