Summary

Transplantation sous-capsulaire rénale du thym embryonnaire Murine traité à la déoxyguanosine de 2'-Deoxyguanosine chez les souris nues

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Nous fournissons une méthode simple et efficace pour transplanter 2′-deoxyguanosine traité E18.5 thymus dans la capsule rénale d’une souris nue. Cette méthode devrait aider dans l’étude de la fonction des cellules épithéliales thymiques et de la maturation des lymphocytes T.

Abstract

Le thymus est un organe immunitaire central important, qui joue un rôle essentiel dans le développement et la différenciation des lymphocytes T. La transplantation de Thymus est une méthode importante pour étudier la fonction épithéliale thymique et la maturation des lymphocytes T in vivo. Ici nous décraurons les méthodes expérimentales utilisées dans notre laboratoire pour transplanter 2′-deoxyguanosine (pour épuiser les lymphocytes du donneur) ont traité le thymume embryonnaire dans la capsule rénale d’une souris nue athymique. Cette méthode est à la fois simple et efficace et ne nécessite pas de compétences ou d’appareils spéciaux. Les résultats obtenus par cette méthode simple ont prouvé que le thymus transplanté peut effectivement soutenir la production de lymphocytes T du destinataire. En outre, plusieurs points clés en ce qui concerne le protocole seront encore élucidés.

Introduction

Le thymus est l’organe immunitaire central, dans les thymocytes subissent une sélection positive et négative, et deviennent des cellules T matures1,2. Une sélection anormale positive ou négative entraîne une immunodéficience ou des pathologies auto-immunes respectivement3,4. Par conséquent, la transplantation d’organe de thymus est une approche importante pour étudier le processus de sélection des lymphocytes T dans le thymus du donneur. Cette méthode est particulièrement cruciale lors de l’analyse de la fonction épithéliale thymique médiée par des mutations génétiques qui causent un phénotype mortel embryonnaire lorsqu’il est muté5.

Afin d’étudier la maturation des lymphocytes T d’un receveur dans le thymus transplanté, l’épuisement des lymphocytes du donneur dans le thymus est nécessaire. À cette fin, embryonnaire de 14, 15 ou 16 jours (E14, E15, E16) thymus est généralement sélectionné6,7. Le thymus des stades plus mûrs peut également être épuisé avec succès des lymphocytes du donneur en traitant avec 2′-deoxyguanosine. Cependant, un protocole détaillé pour épuiser les lymphocytes et l’utilisationde la culture plus ancienne de thymus n’a pas été précédemment décrit 8,9. Tandis que les protocoles de transplantation ont été introduits par plusieurs études10,11, d’autres modifications et améliorations de ces protocoles sont nécessaires.

Notre protocole est séparé en deux parties : (i) L’épuisement des lymphocytes T du stade de développement tardif E18.5 thymus par culture dans les médias contenant 2′-deoxyguanosine. (ii) Transplantation du thymus cultivé en receveurs. Dans cette procédure, nous avons développé un moyen simple de livrer le grand tissu (E18.5 thymus) dans la capsule rénale avec le risque réduit de dommages de rein. Tout en se concentrant sur le thymus stade ultérieur, notre protocole peut également être utilisé directement ou avec des modifications pour la transplantation de thymus à divers stades de développement ou d’autres tissus de taille similaire.

Protocol

Le protocole présenté respecte les lignes directrices du comité d’éthique de l’Université Jinan concernant les soins aux animaux. REMARQUE : Les matériaux utilisés sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. 1. Isolement du thymus embryonnaire Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant l’expérience, et stériliser le banc / hotte avec 70% d’éthanol. À l’aide de dioxyde de carbone, anesthé…

Representative Results

Ici, nous montrons l’isolement E18.5 thymus contenant deux lobes complets (Figure 1). En outre, nous montrons l’aiguille de veine de cuir chevelu qui a été coupée pour former un bisau sur le tube d’infusion (figure 2). Ensuite, nous montrons également une image représentative de la position du thymus qui a été transplanté dans la capsule rénale (Figure 3A) et le thymus après 8 semaines de croissance chez les souris récept…

Discussion

La transplantation sous-capsulaire rénale du thymus embryonnaire est une méthode importante pour étudier la fonction des cellules épithéliales thymiques et le processus de maturation des lymphocytes T in vivo. Bien qu’il existe plusieurs études expérimentales sur la culture embryonnaire d’organe de thymus et la transplantation6,7, notre protocole fournit une procédure alternative simple sur la culture embryonnaire de thymus murine et sous-capsulaire réna…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le programme Start de l’Université De Jinan à S.J. et par le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou en Chine (Grant No. 201704020209 à S.J.). Nous remercions Amy Botta (Département de biologie, Université York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) pour la relecture et l’édition du manuscrit.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

References

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
  2. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
  3. Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
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Cite This Article
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

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