Summary

Transplantação subcapsular renal do Thymus Embryonic murine 2 '-Deoxyguanosine-Tratado em ratos nus

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Nós fornecemos um método simples e eficiente para transplantar 2 ‘-deoxyguanosine tratou e 18.5 timo na cápsula renal de um rato nu. Este método deve auxiliar no estudo da função de células epiteliais tímicas e da maturação das células T.

Abstract

O timo é um importante órgão imunológico central, que desempenha um papel essencial no desenvolvimento e diferenciação de células T. O transplante de timo é um método importante para investigar a função da célula epitelial tímica e a maturação das células T in vivo. Aqui nós descreveremos os métodos experimentais usados dentro de nosso laboratório para transplantar 2 ‘-deoxyguanosine (para esgotar os linfócitos do doador) timo embrionário tratado na cápsula renal de um rato nu camundongos. Este método é simples e eficiente e não requer habilidades especiais ou dispositivos. Os resultados obtidos através deste método simples mostraram que o Timo transplantado pode eficazmente suportar a produção das pilhas de T do receptor. Adicionalmente, vários pontos-chave no que diz respeito ao protocolo serão ainda mais elucidados.

Introduction

O timo é o órgão imunológico central, dentro dos timócitos Timo passam por seleção positiva e negativa, e tornam-se células T maduras1,2. A seleção anormal positiva ou negativa resulta em imunodeficiência ou patologias auto-imunes,respectivamente3,4. Conseqüentemente, a transplantação do órgão do timo é uma aproximação importante para estudar o processo da seleção das pilhas de T no timo do doador. Este método é particular crucial ao analisar a função epithelial Thymic negociada por mutações genéticas que causam o phenotype letal embrionário quando mutado5.

A fim estudar a maturação de pilhas de T de um receptor no timo transplantado, a prostração de linfócitos do doador dentro do timo é necessária. Para este fim, o Timo embrionário de 14, 15 ou 16 dias (E14, E15, E16) é usualmente selecionado6,7. Thymus de estágios mais maduros pode igualmente com sucesso ser esgotado dos linfócitos do doador tratando com 2 ‘-deoxyguanosine. Entretanto, um protocolo detalhado para esgotando linfócitos e o uso da cultura mais velha do Timo não tem sido descrito previamente8,9. Embora os protocolos de transplante tenham sido introduzidos por vários estudos10,11, é necessária uma maior modificação e melhoria desses protocolos.

Nosso protocolo é separado em duas partes: (i) depleção de linfócitos T do estágio de desenvolvimento tardio e 18,5 Timo pela cultura em 2 ‘-deoxyguanosine-contendo meios. (II) transplante do Timo cultivado em receptores. Neste procedimento, nós desenvolvemos uma maneira simples de entregar o grande tecido (E 18.5 Thymus) na cápsula renal com possibilidade reduzida de ferimento de rim. Ao centrar-se no timo mais atrasado da fase, nosso protocolo pode igualmente ser usado diretamente ou com as modificações para a transplantação do timo em vários estágios desenvolventes ou em outros tecidos feitos medida similares.

Protocol

O protocolo apresentado adere às diretrizes do Comitê de ética da Universidade de Jinan em relação aos cuidados com os animais. Nota: os materiais utilizados estão listados na tabela de materiais. 1. isolação do Timo embrionário Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes do experimento, e esterilizar o banco/capuz com 70% etanol. Usando o dióxido de carbono, anestesiar e eutanizar o rato fêmea g…

Representative Results

Aqui nós mostramos o e 18.5 Timo isolado que contem dois lóbulos completos (Figura 1). Além disso, mostramos a agulha da veia do couro cabeludo que foi cortada para formar um chanfro no tubo de infusão (Figura 2). Em seguida, também mostramos uma imagem representativa da posição do Timo que foi transplantado na cápsula renal (Figura 3a) e o Timo após 8 semanas de crescimento dentro dos camundongos receptores (<strong class=…

Discussion

A transplantação subcapsular renal do Timo embrionário é um método importante para estudar a função epithelial Thymic das pilhas e o processo da maturação das pilhas de T in vivo. Embora existam vários estudos experimentais sobre cultura e transplante de órgãos do Timo embrionário6,7, nosso protocolo fornece um procedimento alternativo simples na cultura do Timo embrionário murino e subcapsular renal transplantação para o tecido mais velho do timo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo pacote de início da Universidade de Jinan para S.J. e pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou China (Grant no. 201704020209 a S.J.). Agradecemos a Amy Botta (departamento de biologia, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Canadá) para revisão e edição do manuscrito.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

References

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
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  3. Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
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Cite This Article
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

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