Renale subkapsuläre Transplantation von 2'-Deoxyguanosin-behandeltem murineembryonenden Thymus bei nackten Mäusen
Summary
Wir bieten eine einfache und effiziente Methode, um 2′-Deoxyguanosin behandelt E18.5 Thymus in die Nierenkapsel einer Nacktmaus zu transplantieren. Diese Methode sollte bei der Untersuchung sowohl der Funktion der thymischen Epithelzellen als auch der Reifung von T-Zellen helfen.
Abstract
Der Thymus ist ein wichtiges zentrales Immunorgan, das eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung von T-Zellen spielt. Thymus-Transplantation ist eine wichtige Methode zur Untersuchung der thymischen Epithelzellfunktion und der T-Zellreifung in vivo. Hier werden wir die experimentellen Methoden beschreiben, die in unserem Labor verwendet werden, um 2′-Deoxyguanosin (zur Erschöpfung der Spenderlymphozyten) zu transplantieren, die embryonalen Thymus in die Nierenkapsel einer athymischen Nacktmaus behandelt haben. Diese Methode ist einfach und effizient und erfordert keine besonderen Fähigkeiten oder Geräte. Die Ergebnisse, die mit dieser einfachen Methode erzielt wurden, zeigten, dass transplantierter Thymus die Produktion von T-Zellen des Empfängers effektiv unterstützen kann. Darüber hinaus werden einige Wichtige Punkte in Bezug auf das Protokoll weiter erläutert.
Introduction
Der Thymus ist das zentrale Immunorgan, innerhalb der Thymusthymosyten unterliegen positive und negative Selektion, und werden reife T-Zellen1,2. Abnormale positive oder negative Selektion führt zu Immunschwäche oder Autoimmunpathologien bzw.3,4. Daher ist die Thymusorgantransplantation ein wichtiger Ansatz, um den Prozess der T-Zellen-Selektion im Thymus des Spenders zu untersuchen. Diese Methode ist besonders wichtig bei der Analyse der thymischen Epithelfunktion, die durch Genmutationen vermittelt wird, die embryonalen tödlichen Phänotyp verursachen, wenn sie mutiert5.
Um die Reifung der T-Zellen eines Empfängers im transplantierten Thymus zu untersuchen, ist eine Erschöpfung der Spenderlymphozyten im Thymus erforderlich. Zu diesem Zweck wird embryonaler 14-, 15- oder 16-Tage-Thymus (E14, E15, E16) in der Regel6,7ausgewählt. Thymus aus reiferen Stadien kann auch erfolgreich von den Lymphozyten des Spenders durch die Behandlung mit 2′-Deoxyguanosin aufgebraucht werden. Ein detailliertes Protokoll zur Erschöpfung der Lymphozyten und zur Verwendung älterer Thymuskultur wurde jedoch bisher nicht beschrieben8,9. Während Transplantationsprotokolle durch mehrere Studien10,11eingeführt wurden, ist eine weitere Änderung und Verbesserung dieser Protokolle notwendig.
Unser Protokoll ist in zwei Teile unterteilt: (i) Erschöpfung der T-Lymphozyten aus dem späten Entwicklungsstadium E18.5 Thymus durch Kultur in 2′-deoxyguanosinhaltigen Medien. ii) Transplantation des kultivierten Thymus in Empfänger. In diesem Verfahren haben wir eine einfache Möglichkeit entwickelt, das große Gewebe (E18.5 Thymus) mit reduziertem Wahrscheinlichkeitsfall einer Nierenverletzung in die Nierenkapsel zu liefern. Während wir uns auf thymus im späteren Stadium konzentrieren, kann unser Protokoll auch direkt oder mit Modifikationen für die Transplantation von Thymus in verschiedenen Entwicklungsstadien oder anderen ähnlich großen Geweben verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die renale subkapsuläre Transplantation von embryonaischem Thymus ist eine wichtige Methode, um die Funktion der thymischen Epithelzellen und den Prozess der T-Zellenreifung in vivo zu untersuchen. Obwohl es mehrere experimentelle Studien über embryonale Thymus-Organkultur und Transplantation6,7gibt, bietet unser Protokoll ein einfaches alternatives Verfahren zur murinen embryonalen Thymuskultur und renalen subkapsulären Transplantation für älteres Thymusgew…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Start Package der Jinan University to S.J. und das Science and Technology Program of Guangzhou China (Grant No. 201704020209 to S.J.) unterstützt. Wir danken Amy Botta (Department of Biology, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Kanada) für das Korrekturlesen und Bearbeiten des Manuskripts.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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