زرع تحت القبعات الكلوية من الغدة الصعترية الجنينية Murine المعالجة 2'-ديوكسيغوانوسين في الفئران عارية
Summary
نحن نقدم طريقة بسيطة وفعالة لزرع 2′-ديوكسيغوانوسين المعالجة E18.5 الغدة الصعترية في كبسولة الكلى من فأر عارية. هذه الطريقة ينبغي أن يساعد في دراسة كل من وظائف الخلايا الظهارية الثيميك ونضج الخلايا T.
Abstract
الغدة الصعترية هو جهاز مناعي مركزي مهم، والذي يلعب دورا أساسيا في تطوير وتمايز الخلايا T. زراعة الغدة الصعترية هي طريقة هامة للتحقيق في وظيفة الخلايا الظهارية الغدية ونضج الخلايا T في الجسم الحي. هنا سوف نصف الطرق التجريبية المستخدمة في مختبرنا لزرع 2′-ديوكسيغوانوسين (لاستنفاد الخلايا الليمفاوية المانحة) علاج الغدة الصعترية الجنينية في كبسولة الكلى من فأر ة عارية الكمية. هذه الطريقة بسيطة وفعالة على حد سواء ولا تتطلب مهارات أو أجهزة خاصة. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة البسيطة أن الغدة الصعترية المزروعة يمكن أن تدعم بشكل فعال إنتاج الخلايا T المتلقي. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم زيادة توضيح عدة نقاط رئيسية فيما يتعلق بالبروتوكول.
Introduction
الغدة الصعترية هو الجهاز المناعي المركزي ، داخل الغدة الصعترية تخضع لاختيار إيجابي وسلبي ، وتصبح ناضجة الخلايا T1،2. نتائج اختيار إيجابية أو سلبية غير طبيعية في نقص المناعة أو أمراض المناعة الذاتية على التوالي3،4. لذلك، زرع الأعضاء الغدة الصعترية هو نهج مهم لدراسة عملية اختيار الخلايا T في الغدة الصعترية المانحة. هذه الطريقة حاسمة بشكل خاص عند تحليل وظيفة الظهارية الثيميك بوساطة الطفرات الجينية التي تسبب النمط الظاهري القاتل الجنيني عند تغيير5.
من أجل دراسة نضج الخلايا T المتلقي في الغدة الصعترية المزروعة، استنفاد الخلايا الليمفاوية المانحة داخل الغدة الصعترية أمر ضروري. ولهذا الغرض، عادة ما يتم اختيار الغدة الصعترية الجنينية 14-، 15- أو 16 يوما (E14، E15، E16) الغدة الصعترية6،7. الغدة الصعترية من مراحل أكثر نضجا يمكن أيضا أن تستنفد بنجاح من الخلايا الليمفاوية المانحة عن طريق علاج مع 2′-ديوكسيغوانوسين. ومع ذلك، لم يتم وصف بروتوكول مفصل لاستنفاد الخلايا الليمفاوية واستخدام ثقافة الغدة الصعترية القديمة من قبل8،9. في حين تم إدخال بروتوكولات زرع من قبل العديد من الدراسات10،11، ومن الضروري إجراء مزيد من التعديل وتحسين هذه البروتوكولات.
يتم فصل بروتوكولنا إلى جزأين: ‘1’ استنفاد الخلايا الليمفاوية T من مرحلة النمو المتأخرة E18.5 الغدة الصعترية من قبل الثقافة في 2′-deoxyguanosine التي تحتوي على وسائل الإعلام. ‘2’ زرع الغدة الصعترية المثقفة في المتلقين. في هذا الإجراء، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لتسليم الأنسجة الكبيرة (E18.5 thymus) في كبسولة الكلى مع انخفاض فرصة الإصابة في الكلى. في حين تركز على الغدة الصعترية في مرحلة لاحقة، يمكن أيضا أن تستخدم بروتوكولنا مباشرة أو مع تعديلات لزرع الغدة الصعترية في مختلف مراحل النمو أو غيرها من الأنسجة ذات الحجم المماثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
زرع الكُبسة الكلوية للمُدَدَدَيّة الجنينية هو طريقة هامة لدراسة وظيفة الخلايا الظهارية الثيميك وعملية نضج الخلايا التائية في الجسم الحي. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات التجريبية على زراعة الأعضاء الغدة الصعترية الجنينية وزرع6،7، بروتوكولنا يوفر …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل حزمة البداية من جامعة جينان إلى S.J. وبرنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو الصين (منحة رقم 201704020209 إلى S.J.). نشكر إيمي بوتا (قسم البيولوجيا، جامعة يورك، تورنتو، ON M3J 1P3، كندا) على التدقيق والتحرير للمخطوطة.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
