הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים
Summary
אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 ‘-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.
Abstract
התימוס הוא איבר החיסון המרכזי חשוב, אשר ממלא תפקיד חיוני בפיתוח והבידול של תאים T. השתלת התימוס היא שיטה חשובה לחקירת תפקוד התא האפיתל הרתי ו T התבגרות תאים ב vivo. כאן נתאר את השיטות הנסיוניות המשמשות בתוך המעבדה שלנו להשתלה 2 ‘-deoxyguanosine (כדי לרוקן לימפוציטים של התורם) שטופלו בתימוס מתחלקים לתוך קפסולת הכליה של עכבר עירום athymic. שיטה זו היא פשוטה ויעילה ואינה דורשת מיומנויות או מכשירים מיוחדים. התוצאות שהתקבלו באמצעות שיטה זו פשוטה הראה כי התימוס המושתלים יכול לתמוך ביעילות הייצור של תאי T של המטופל. בנוסף, מספר נקודות מפתח ביחס לפרוטוקול יהיה מובהר עוד יותר.
Introduction
התימוס הוא איבר החיסון המרכזי, בתוך thymocytes התימוס עוברים בחירה חיובית ושלילית, ולהיות תאים T בוגרים1,2. בחירה חיובית או שלילית לא תקין תוצאות כשל חיסוני או הפתווגיות אוטואימוניות בהתאמה3,4. לכן, השתלת איברים התימוס היא גישה חשובה ללמוד את התהליך של בחירת תאים T ב בלוטת התימוס של התורם. שיטה זו היא חיונית במיוחד כאשר ניתוח הרתי אפיתל בתיווך על ידי מוטציות גנים אשר לגרום פנוטיפים מעובריים קטלני כאשר מוטציה5.
כדי ללמוד את ההבשלה של תאים T של המטופל בתימוס המושתלים, דלדול לימפוציטים של התורם בתוך התימוס הוא הכרחי. למטרה זו, עובריים 14, 15 או 16 יום (E14, E15, E16) התימוס הוא בדרך כלל בחירה6,7. התימוס משלבים בוגרים יותר יכול להיות גם מרוקן בהצלחה של לימפוציטים של התורם על ידי טיפול עם 2 ‘-deoxyguanosine. עם זאת, פרוטוקול מפורט עבור לימפוציטים מכלה ושימוש של תרבות בלוטת התימוס הישנה לא תוארה קודם לכן8,9. בעוד פרוטוקולי ההשתלה הוכנסו על ידי מספר מחקרים10,11, שינוי נוסף ושיפור של פרוטוקולים אלה הוא הכרחי.
הפרוטוקול שלנו מופרד לשני חלקים: (i) המחסור של לימפוציטים T משלב התפתחותי מאוחר E 29.8 בלוטת התימוס על ידי תרבות ב 2 ‘-deoxyguanosine המכיל מדיה. (ii) השתלת התימוס התרבותי לתוך הנמענים. בהליך זה, פיתחנו דרך פשוטה לספק את הרקמה הגדולה (E 29.8 בלוטת התימוס) לתוך קפסולה כליות עם סיכוי מופחת של פציעה בכליות. בעוד ממוקד על בלוטת התימוס בשלב מאוחר יותר, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש גם ישירות או עם שינויים עבור השתלת בלוטת התימוס בשלבים התפתחותיים שונים או רקמות בגודל דומה אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subcapsular הכליות השתלת בלוטת התימוס העוברית היא שיטה חשובה ללמוד את התאים אפיתל הרתי בתפקוד ואת תהליך ההבשלה של תאים T ב vivo. למרות שיש מחקרים ניסיוניים מספר על תרבות הגוף מעובריים התימוס השתלת6,7, הפרוטוקול שלנו מספק הליך חלופי פשוט על תרבות התימוס מורנין עובריי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי חבילת ההתחלה של אוניברסיטת ג’ינאן כדי S.J. ועל ידי המדע והטכנולוגיה תוכנית של סין גואנגג’ואו (גרנט No. 201704020209 כדי S.J.). אנו מודים לאמי בוטה (מחלקת הביולוגיה, אוניברסיטת יורק, טורונטו, על M3J 1P3, קנדה) להגהה ועריכה של כתב היד.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
