ヌードマウスにおける2'-デオキシグアノシン処理マウス胚性胸腺の腎サブカプセル移植
Summary
我々は、ヌードマウスの腎カプセルに2′-デオキシグアノシン処理E18.5胸腺を移植するための簡単かつ効率的な方法を提供する。この方法は、甲状腺上皮細胞機能とT細胞の成熟の両方の研究に付加されるべきである。
Abstract
胸腺は重要な中央免疫器官であり、T細胞の発達と分化に不可欠な役割を果たしている。胸腺移植は、生体内の甲状腺細胞機能およびT細胞の成熟を調るための重要な方法である。ここでは、2’デオキシグアノシン(ドナーのリンパ球を枯渇させる)をアチミックヌードマウスの腎カプセルに移植するために当研究室で使用される実験方法について説明します。この方法は、シンプルかつ効率的であり、特別なスキルやデバイスを必要としません。この簡易方法を用いられた結果は、移植された胸腺がレシピエントのT細胞産生を効果的にサポートできることを示した。さらに、プロトコルに関するいくつかの重要なポイントがさらに解明されます。
Introduction
胸腺は中央免疫器官であり、胸腺胸腺細胞内では陽性および陰性の選択を受け、成熟したT細胞1、2になる。異常な陽性または陰性の選択は、それぞれ3、4の免疫不全または自己免疫病理をもたらす。したがって、胸腺臓器移植は、ドナーの胸腺におけるT細胞選択の過程を研究するための重要なアプローチである。この方法は、変異時に胚致死表現型を引き起こす遺伝子変異によって媒介される胸腺上皮機能を分析する場合に特に重要である5.
移植された胸腺におけるレシピエントのT細胞の成熟を研究するためには、胸腺内のドナーリンパ球の枯渇が必要である。この目的のために、胚14-、15-または16日(E14、E15、E16)胸腺は、通常6、7を選択される。より成熟した段階からの胸腺はまた、2′-デオキシグアノシンで治療することによってドナーのリンパ球を正常に枯渇させることができる。しかし、リンパ球を枯渇させ、古い胸腺培養の使用のための詳細なプロトコルは、以前に記載されていない8,9.移植プロトコルは、いくつかの研究10、11によって導入されているが、これらのプロトコルのさらなる改変および改善が必要である。
我々のプロトコルは2つの部分に分かれています:(i)2′-デオキシグアノシン含有培地における培養による後期発達段階E18.5胸腺からのTリンパ球の枯渇。(ii) 培養胸腺をレシピエントに移植する。この手順では、腎臓損傷の可能性を減らした腎カプセルに大きな組織(E18.5胸腺)を届ける簡単な方法を開発しました。後の段階の胸腺に焦点を当てながら、私たちのプロトコルはまた、様々な発達段階または他の同様のサイズの組織で胸腺の移植のための変更で直接または使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
胚性胸腺の腎皮下移植は、子宮上皮細胞機能および生体内でのT細胞成熟の過程を研究する重要な方法である。胚性胸腺臓器培養と移植に関するいくつかの実験的研究があるが、我々のプロトコルは、マウス胚性胸腺培養および腎皮下に関する簡単な代替手順を提供する古い胸腺組織の移植。
私たちのプロトコルは、いくつか?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、済南大学のS.J.へのスタートパッケージと広州中国科学技術プログラム(助成金第201704020209号からS.J.)によって支援されました。私たちは、原稿の校正と編集のためにエイミー・ボッタ(ヨーク大学、トロント、ON M3J 1P3、カナダ)に感謝します。
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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