Akciğer adenokarsinoma PC-9 hücrelerinden afatinib-direnç hücre hatları kurulması için bir yöntem geliştirilmiştir, ve dayanıklı hücreler karakterizedir. Dayanıklı hücreler epidermal büyüme faktörü reseptör Tirozin kinaz inhibitörü-direnç mekanizmaları, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri olan hastalar için uygulanabilir araştırmak için kullanılabilir.
Moleküler hedef inhibitörlerine elde edilen direnç kanser tedavisinde ciddi bir sorundur. Akciğer kanseri çoğu ülkede kanser ile ilgili ölümün önde gelen nedeni kalır. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) gibi “Onkojenik sürücü mutasyonlarının” keşfi-mutasyonları aktive etmek ve EGFR Tirozin kinaz Inhibitörleri (tkis) (Gefitinib, erlotinib) moleküler hedeflenen ajanlarının sonraki gelişimi afatinib, dacomitinib ve osimertinib) son yıllarda akciğer kanseri tedavisini dramatik bir şekilde değiştirdi. Ancak, bu ilaçlar hala küçük hücreli olmayan akciğer kanseri olan hastalarda etkili değildir (NSCLC) EGFR-aktive mutasyonları taşıyan. Elde edilen direncin ardından, NSCLC ‘nin sistemik ilerlemesi EGFR mutasyon pozitif NSCLC hastalarının tedavisinde önemli bir engel teşkil etmektedir. Burada, EGFR eXoN 19 ‘ da 15 baz çifti silme işlemlerinin EGFR aktive edilen mutasyonlarını barındıran NSCLC PC-9 hücrelerinden üç bağımsız elde edilen afatinib dirençli hücre hatları kurmak için kademeli bir doz yükselmesi yöntemi sunuyoruz. Üç bağımsız afatinib-direnç hücresi çizgilerinin karakterize edilmesi için yöntemler kısaca sunulmuştur. EGFR TKIs ‘lere elde edilen direnç mekanizmaları heterojen. Bu nedenle, EGFR-TKIs ‘ e elde edilen direnç ile birden fazla hücre çizgisi incelenmelidir. On ila on iki ay bu kademeli doz yükselme yaklaşımı kullanarak elde direnç ile hücre hatları elde etmek için gereklidir. Yeni elde edilen direnç mekanizmalarının keşfi daha etkili ve güvenli terapötik stratejilerin gelişmesine katkıda bulunacak.
Beş Tirozin kinaz inhibitörü, Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib ve osimertinib dahil olmak üzere epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) hedefleme şu anda EGFR mutasyon-pozitif küçük hücreli olmayan akciğer hastaları tedavisinde kullanılabilir kanser (NSCLC). Son on yıl içinde, bu tür hastalar için tedaviler yeni potansiyel EGFR-TKIs keşfi ile dramatik gelişmeye uğramıştır. Akciğer adenokarsinomu olan hastalar arasında, EGFR ‘de somatik mutasyonlar Asya ‘nın yaklaşık% 50 ve Kafkas hastalarının% 15 ‘ inde1olarak tanımlanır. EGFR ‘deki en yaygın mutasyonlar EGFR eXoN 21 ve 15 baz çifti (BP) silme işlemi olan EGFR eXoN 192‘ de L858R nokta mutasyonudur. NSCLC olan EGFR mutasyon-pozitif hastalarda, EGFR-TKIs, platin Doublet kemoterapi3‘ ün önceki standardına kıyasla reaksiyon oranlarını ve klinik sonuçları geliştirir.
Gefitinib ve erlotinib ilk onaylı küçük molekül inhibitörleri ve genellikle ilk nesil EGFR TKIs olarak adlandırılır. Bu EGFR TKIs ‘ler ATP ile rekabet ederek Tirozin kinaz aktivitesini engelleyin ve ATP bağlama sitelerine4‘ e geri döndürülebilir şekilde baðla. Afatinib, EGFR ‘nin Tirozin kinaz etki alanına geri dönülemez ve birbirine bağlayan ikinci nesil EGFR TKı ‘dir ve Pan-Human EGFR aile inhibitörü5olarak karakterize edilir.
NSCLC hastalarında bu tedavilerin dramik yararına olmasına rağmen, elde edilen direnç kaçınılmazdır. İlk ve ikinci nesil EGFR tkis ‘lere karşı en sık görülen direnç mekanizması, T790M% 50-70 ‘ de mevcut olan EGFR eXoN 20 ‘ de, tümör numunelerinin6,7,8‘ inde ortaya çıkmasıdır. Diğer direnç mekanizmaları arasında bypass sinyalleri (MET, ıGF1R, ve HER2), küçük hücreli akciğer kanserine dönüşüm ve epitelyal-mesenkimal geçiş indüksiyonu, klinik öncesi ve klinik olarak9. EGFR TKIs ‘lere karşı direnç mekanizmaları heterojen. Preklinik çalışmalarda yeni direnç mekanizmaları tanımlayarak, direncin üstesinden gelmek için yeni terapikler geliştirmek mümkün olabilir. Hastaların klinik avantajını en üst düzeye çıkaracak optimum dizi terapileri direnç mekanizmalarını ve terapötik hedefi dikkate almanız gerekir.
Tüm sonraki deneylerin temeli olduğu için, sağ ebeveyn hücresi çizgisini seçmek zorunludur. Seçim stratejileri klinik alaka ile başlar; bir kemoterapi ve radyasyon naif hücre hattı seçmek için gereklidir. Önceki kemoterapötik ve/veya radyatif tedavi direnç yolları ve ilaç direnci işaretçileri ifade değişikliklerinin değiştirilmesi neden olabilir. Bu çalışmada, EGFR eXoN 19 ‘ da 15 BP silmeleri taşıyan PC-9 hücreleri, afatinib ‘e elde edilen direnç kurulması için kullanılmaktadır. Bu hücre hattı, önceden kemoterapi ve radyasyon alamıyordu Japon NSCLC hasta, türetilmiştir.
Çünkü afatinib günlük bazda sözlü olarak uygulanır, sürekli in vitro tedavi, hücrelerin afatinib varlığında sürekli kültürlü olduğu klinik olarak alakalı olacaktır. Deney çeşitli adımlarda kullanılan ilaçların dozu seçilen ebeveyn hücre çizgisi için optimize edilmelidir. Bir sitotoksisite tahlil uygun bir ilaç aralığı belirlemek için kullanılabilir, hangi ilacın farmakokinetik bilgileri ile karşılaştırılabilir olmalıdır.
Seçim işlemi boyunca, hücrelerin tüm nüfusu tek bir grup olarak korunur; Klonlama veya diğer ayırma yöntemleri kullanılmaz. Hücreler önce sürekli olarak ilacın düşük bir seviyeye maruz kalır. Daha sonra, hücrelerin ilacın varlığında büyümeye adapte sonra, ilacın doz yavaş ilaç son optimum doz arttı10,11. Alternatif olarak, bir nabız ilaç yönetimi veya mutagenez de ilaç tedavisi öncesinde gerçekleştirilen direnç hücreleri seçmek için kullanılabilir 12,13. Ne yazık ki, ilaç direncinin gelişmemesi durumlarında genellikle rapor edilmez. Seçim stratejileri, klinik olarak ilgili direnç yeniden inşa etmek için kanser hastalarının koşullarını taklit etmeye çalışmak amacıyla geliştirilmiştir. Bazen, ilaç direnci mekanizmaları ile ilişkili moleküler değişiklikleri belirlemek için, yüksek bir ilaç konsantrasyonu kullanılır. Bu model daha az klinik olarak alakalı hale gelir.
Burada, EGFR eXoN 19 ‘ da 15 BP silmenin yanı sıra afatinib dirençli hücre hatlarının ilk karakterizasyonu ile PC-9 hücrelerinden üç bağımsız afatinib dirençli hücre hattı kurmak için bir yöntem açıklanmaktadır.
Burada, üç bağımsız afatinib dirençli hücre hattı kurmak için bir yöntem tarif ve Ebeveyn PC-9 hücrelerine kıyasla bu hücreleri karakterize. Kademeli doz yükselmesi pozlama, Ebeveyn PC-9 hücreleri 10-12 ay bir süre içinde afatinib direnç elde. Klinik olarak, EGFR TKIs direnç mekanizmaları heterojen, ve bu nedenle, afatinib ile ilk tedavi sonra, PC-9 hücreler üç bağımsız P100 yemekleri ayrıldı ve afatinib daha fazla maruz kaldı. Başlangıçta, hücre büyümesi önemli ölçüde yavaşladı, …
The authors have nothing to disclose.
Biz Ingilizce dil düzenleme ile yardım için onların düşünceli yorum ve Editage için gelişmiş kanser translational Araştırma Enstitüsü üyesi teşekkür ederiz. Bu çalışma JSPS KAKENHI tarafından desteklenmektedir (Grant numarası: 16K09590 to T.Y.).
afatinib | Selleck | S1011 | |
anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
DMSO | Wako | 043-07216 | |
ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
FBS | gibco | 26140-079 | |
GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
TBST powder | sigma | T9039 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
96 well microplate | Thermo | 130188 |