שיטה להקמת קווי ההתנגדות afatinib מ-ריאה אדנוקרצינומה PC-9 תאים פותחה, תאים עמידים היו מאופיין. התאים עמידים ניתן להשתמש כדי לחקור את הגידול באפידרמיס קולטן גורם טירולה קינאז מעכב-התנגדות מנגנונים, ישים עבור חולים עם סרטן ריאות תא לא קטן.
התנגדות נרכש מעכבי היעד המולקולרי היא בעיה חמורה בטיפול בסרטן. סרטן ריאות נשאר הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן ברוב המדינות. גילוי של “מוטציות מנהלי התקן אונגניים”, כגון קולטן באפידרמיס גורם גדילה (egfr)-הפעלת מוטציות, ובעקבות פיתוח של סוכנים ממוקדים מולקולריים של egfr טירוצין קינאז מעכבי (tkis) (gefitinib, ארסבה, הטיפול בסרטן ריאות שונה באופן דרמטי בעשורים האחרונים. עם זאת, תרופות אלה עדיין לא יעיל בחולים עם סרטן ריאות תא לא קטן (NSCLC) נושאת Egfr-הפעלת מוטציות. לאחר התנגדות נרכש, ההתקדמות מערכתית של NSCLC נשאר מכשול משמעותי בטיפול בחולים עם EGFR מוטציה חיובית NSCLC. כאן, אנו מציגים שיטת הסלמה מינון חורג להקמת שלושה עצמאיים afatinib שנרכשו קווי תאים מתוך nsclc PC-9 תאים מחסה egfr-הפעלת מוטציות של 15 בסיס זוג מחיקות ב egfr אקסון 19. שיטות לאפיון שלושת קווי הצינוק העצמאיים של afatinib מוצגים לזמן קצר. מנגנוני ההתנגדות הנרכשים ל-EGFR TKIs הם הטרוגנית. לכן, יש לבדוק קווי תאים מרובים עם עמידות בפני EGFR-TKIs. 10 עד 12 חודשים נדרשים להשיג קווי תאים עם התנגדות נרכש באמצעות הגישה הזאת הסלמה מינון חורג. הגילוי של מנגנוני ההתנגדות החדשניים יתרום לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות ובטוחות יותר.
חמש טירולך קינאז מעכבי, מיקוד קולטן באפידרמיס גורם הצמיחה (EGFR), כולל gefitinib, erlotinib, החוליה, דקאומוטיניב, ו osimertinib זמינים כרגע לטיפול בחולים עם מוטציה EGFR-חיובי התא לא קטן סרטן (NSCLC). במהלך העשור האחרון, טיפולים עבור חולים כאלה עברו התפתחות דרמטית עם התגלית של EGFR פוטנציאל חדש-TKIs. בין חולים עם אדנוקרצינומה ריאה, מוטציות סומתיות ב Egfr מזוהים כ 50% של אסיה ו 15% של החולים הקווקזי1. המוטציות הנפוצות ביותר ב-egfr הן מוטציה של L858R point ב-egfr אקסון 21 ו -15 בסיס זוג (bp) מחיקות ב-egfr אקסון 192. ב-EGFR מוטציה-חולים חיוביים עם NSCLC, EGFR-TKIs לשפר את שיעורי התגובה ואת התוצאות הקליניות בהשוואה לתקן הקודם של פלטינה כימותרפיה3.
Gefitinib ו טרסבה היו מעכבי המולקולה הראשונה קטנה ומכונים בדרך כלל egfr tkis הדור הראשון. אלה EGFR TKIs לחסום את פעילות טירוצין קינאז על ידי מתחרה עם ATP וכריכה הפיכה הפיך לאתרי כריכת ATP4. Afatinib הוא הדור השני EGFR TKI, כי מאוגד הפיך והרב נקשר לתחום טירוצין קינאז של EGFR והוא מאופיין מעכבי משפחה הפאן-אנושיים5.
למרות התועלת הרבה של טיפולים אלה בחולים עם NSCLC, התנגדות נרכש הוא בלתי נמנע. מנגנון ההתנגדות השכיח ביותר נגד הדור הראשון והשני של egfr tkis הוא הופעתה של המוטציה T790M ב-egfr אקסון 20, אשר קיים 50-70% של דגימות הגידול6,7,8. מנגנוני התנגדות אחרים כוללים אותות עוקפים (כדי MET, IGF1R, ו HER2), טרנספורמציה לסרטן ריאות תא קטן, ו אינדוקציה של המעבר אפיתל-to-mesenchal, אשר מתרחשים מראש קלינית קלינית. מנגנוני ההתנגדות ל-EGFR TKIs הם הטרוגנית. על-ידי זיהוי מנגנוני ההתנגדות החדשניים במחקרים קדם-קליניים, ייתכן שניתן יהיה לפתח therapeutics הרומן כדי להתגבר על התנגדות. טיפולים אופטימליים הרצף המקסם את התועלת הקלינית לחולים חייבים לשקול את מנגנוני ההתנגדות המטרה הטיפולית.
זה הכרחי לבחור את קו התא ההורה הנכון, כפי שהוא בסיס של כל הניסויים הבאים. אסטרטגיות הבחירה מתחילות ברלוונטיות קלינית; יש צורך לבחור כימותרפיה וקרינה קו התא נאיבי. הטיפול כימותרפיות הקודם ו/או רדיוטיבי עלול לגרום לשינוי של מסלולים התנגדות ושינויים של הביטוי של סמנים התנגדות התרופה. במחקר זה, PC-9 תאים, נשיאת 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19, מועסקים להקמת התנגדות נרכש afatinib. קו תא זה נגזר מחולה NSCLC יפני, אשר לא קיבל כימותרפיה והקרנות קודמות.
מכיוון afatinib מנוהל דרך הפה על בסיס יומי, רציף טיפול מחוץ למים, שבו התאים הם מתורבתים כל הזמן בנוכחות afatinib יהיה רלוונטי קלינית. המינון של תרופות המשמשות בשלבים השונים של הניסוי חייב להיות ממוטב עבור קו התא הורים נבחר. ניתן להשתמש באפשרות לקביעת טווח תרופות מתאים, שאמור להיות דומה למידע הפרמקוקינטי של הסם.
בכל תהליך הבחירה, כל אוכלוסיית התאים נשמרת כקבוצה אחת; לא נעשה שימוש בשכפול או בשיטות הפרדה אחרות. התאים הראשונים נחשפים ברציפות לרמה נמוכה של הסם. לאחר מכן, לאחר שהתאים להסתגל לצמוח בנוכחות הסם, המינון של הסם עלה לאט למינון האופטימלי הסופי של התרופה10,11. לחילופין, ניתן להשתמש בטיפול בסמים או במוטגנזה לצורך בחירת תאי התנגדות, המבוצעים גם לפני טיפול תרופתי 12,13. למרבה הצער, מקרים בהם התנגדות לסמים אינה מצליחה להתפתח בדרך כלל לא מדווחת. אסטרטגיות הבחירה מפותחות במטרה לנסות לחקות את התנאים של חולי סרטן לבנייה מחדש של ההתנגדות הרלוונטית קלינית. לעיתים, כדי לזהות שינויים מולקולריים הקשורים במנגנונים של עמידות לסמים, נעשה שימוש בריכוז סמים גבוה. המודל הזה הופך להיות. פחות רלוונטי מבחינה קלינית
כאן, אנו מתארים שיטה להקמת שלושה קווי afatinib עצמאיים עמידים מפני PC -9 תאים מחסה 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19, כמו גם את האפיון הראשוני של קווי התאים העמידים afatinib.
כאן, תיארנו שיטה להקמת שלושה קווים עצמאיים afatinib עמידים ומאופיין תאים אלה על ידי השוואה לתאי PC-9 הורים. על ידי חשיפה מינון הסלמה החורגת, ההורים PC-9 תאים רכשה עמידות afatinib לאורך תקופה של 10-12 חודשים. מבחינה קלינית, מנגנוני ההתנגדות של EGFR TKIs הם הטרוגנית, ולכן, לאחר הטיפול הראשוני עם afatinib, PC-9 תאים חו?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחבר במכון לחקר הסרטן המתקדם של מכון המחקר לקבלת הערות מתחשבות ועריכה עבור עזרתם בעריכת השפה האנגלית. עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI (מספר מענק: 16K09590 to T.Y.).
afatinib | Selleck | S1011 | |
anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
DMSO | Wako | 043-07216 | |
ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
FBS | gibco | 26140-079 | |
GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
TBST powder | sigma | T9039 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
96 well microplate | Thermo | 130188 |