Разработан метод установления клеточных линий афатиниб-сопротивления из клеток легких Аденокарциномы ПК-9, и были охарактеризованы устойчивые клетки. Устойчивые клетки могут быть использованы для исследования эпидермального фактора роста рецептора тирозина киназы ингибитор-резистентность механизмов, применимых для пациентов с немелкоклеточным раком легких.
Приобретенная устойчивость к молекулярным ингибиторам целей является серьезной проблемой в терапии рака. Рак легких остается основной причиной смерти, связанной с раком, в большинстве стран. Открытие “онкогенных мутаций драйвера”, таких как рецепторэпидермального фактора роста (EGFR)-активирующие мутации, и последующее развитие молекулярных целевых агентов ингибиторов тирозина киназы EGFR (TKIs) (гефитиниб, эрлотиниб, afatinib, dacomitinib, и osimertinib) резко изменили лечение рака легких в последние десятилетия. Тем не менее, эти препараты по-прежнему не эффективны у пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC), несущими EGFR-активирующие мутации. После приобретенной резистентности, системное прогрессирование NSCLC остается значительным препятствием в лечении пациентов с мутацией-положительным И ЕНФР NSCLC. Здесь мы представляем пошаговый метод эскалации дозы для создания трех независимых приобретенных афатиниб-устойчивых клеточных линий из NSCLC PC-9 клеток укрывательство EGFR-активирующих мутаций 15-базовых удаляний пары в EGFR exon 19. Кратко представлены методы характеристики трех независимых линий клеток сопротивления афатиниба. Приобретенные механизмы сопротивления ЭГФР ТКИ неоднородны. Поэтому необходимо изучить несколько клеточных линий с приобретенным сопротивлением EGFR-TKIs. Десять-двенадцать месяцев, необходимых для получения клеточных линий с приобретенным сопротивлением, используя этот шаг подход эскалации дозы. Открытие новых механизмов приобретенного сопротивления будет способствовать разработке более эффективных и безопасных терапевтических стратегий.
Пять ингибиторов тирозина киназы, ориентированные на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), в том числе гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дакомитиниб и осимертиниб в настоящее время доступны для лечения пациентов с EGFR мутацией-положительной немелкоклеточной легкой рака (NSCLC). За последнее десятилетие, терапии для таких пациентов претерпели драматические разработки с открытием новых потенциальных EGFR-TKIs. Среди пациентов с аденокарциномой легких соматические мутации в ЭГФР выявлены примерно у50% азиатских и 15% кавказских пациентов 1. Наиболее распространенными мутациями в EGFR являются мутация точки L858R в EGFR exon 21 и 15 базовых парах (bp) удаления в EGFR exon 192. В EGFR мутационно-положительных пациентов с NSCLC, EGFR-TKIs улучшить скорость ответа и клинические исходы по сравнению с предыдущим стандартом платиновой химиотерапии дублет3.
Gefitinib и эрлотиниб были первыми утвержденными ингибиторами малых молекул и, как правило, называются EGFR TKIs первого поколения. Эти EGFR ТКИ блокируют активность тирозина киназы, конкурируя с АТФ и обратимо связывая с ат-плехаумом4. Afatinib является второе поколение EGFR TKI, что необратимо и ковалентно связывается с тиразин киназы области EGFR и характеризуется как пан-человеческого ингибитора семьи EGFR5.
Несмотря на драматическую пользу этих методов лечения у пациентов с NSCLC, приобретенная резистентность неизбежна. Наиболее распространенным механизмом сопротивления против первого и второго поколения EGFR TKIs является появление мутации T790M в EGFRexon 20, которая присутствует в 50-70% образцов опухоли 6,7,8. Другие механизмы сопротивления включают сигналы шунтирования (к MET, IGF1R, и HER2), преобразование в мелкоклеточный рак легких, и индукции эпителиального к мезенхимальному переходу, который происходит до клинически и клинически9. Механизмы сопротивления ЭГФР ТКИ неоднородны. Путем определять новые механизмы сопротивления в доклинических изучениях, может быть по возможности начать новые терапии для того чтобы отжать сопротивление. Оптимальная последовательность терапии, которые максимизируют клиническую пользу для пациентов должны рассмотреть механизмы сопротивления и терапевтической цели.
Крайне важно выбрать правильную родительскую клеточную линию, так как она является основой всех последующих экспериментов. Стратегии отбора начинаются с клинической значимости; необходимо выбрать химиотерапию и лучевую наивную клеточную линию. Предыдущая химиотерапевтическая и/или радиационная обработка может вызвать изменение путей сопротивления и изменения выражения маркеров лекарственной резистентности. В этом исследовании, PC-9 клетки, несущие 15 bp удаления в EGFR exon 19, используются для создания приобретенных устойчивость к afatinib. Эта клеточная линия была получена от японского пациента NSCLC, который не получил предварительной химиотерапии и радиации.
Потому что afatinib вводится устно на ежедневной основе, непрерывное лечение в пробирке, где клетки культивируются постоянно в присутствии afatinib будет клинически актуальным. Доза препаратов, используемых в различных этапах эксперимента, должна быть оптимизирована для родительской клеточной линии выбранной. Для определения подходящего лекарственного диапазона можно использовать цитотоксический асссс, который должен быть сопоставим с фармакокинетической информацией препарата.
На протяжении всего процесса отбора вся популяция клеток поддерживается как единая группа; клонирование или другие методы разделения не используются. Клетки сначала постоянно подвергаются воздействию низкого уровня препарата. Впоследствии, после того, как клетки адаптируются к росту в присутствии препарата, дозу препарата медленно увеличивается до конечной оптимальной дозы препарата10,11. Кроме того, пульс препарата-администрации или мутагенеза могут быть использованы для выбора клеток резистентности, которые также выполняются до медикаментозного лечения 12,13. К сожалению, случаи, когда лекарственная устойчивость не развивается, как правило, не сообщаются. Стратегии отбора разрабатываются с целью имитации условий онкологических больных для восстановления клинически релевантной резистентности. Иногда для выявления молекулярных изменений, связанных с механизмами лекарственной устойчивости, используется высокая концентрация препарата. Эта модель становится менее клинически актуальной.
Здесь мы описываем метод создания трех независимых афатиниб-устойчивых клеточных линий из клеток PC-9, укрывающих 15 bp удаления в EGFR exon 19, а также первоначальную характеристику устойчивых к афатинибным клеточным линиям.
Здесь мы описали метод создания трех независимых афатиниб-устойчивых клеточных линий и охарактеризовали эти клетки по сравнению с родительскими клетками PC-9. Пошагово облучение дозы, родительские клетки PC-9 приобрели устойчивость к afatinib в течение 10-12 месяцев. Клинически, механизмы сопр…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим члена Института передовых исследований рака за их вдумчивые комментарии и Editage за их помощь в редактировании английского языка. Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (грант номер: 16K09590 до T.Y.).
afatinib | Selleck | S1011 | |
anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
DMSO | Wako | 043-07216 | |
ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
FBS | gibco | 26140-079 | |
GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
TBST powder | sigma | T9039 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
96 well microplate | Thermo | 130188 |