تم تطوير طريقة لإنشاء خطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب من خلايا سرطان الغدة الرئوية PC-9، وتميزت الخلايا المقاومة. يمكن استخدام الخلايا المقاومة للتحقيق في مستقبلات عامل النمو البشرة التيروزين كيناز آليات مقاومة مثبطات، تنطبق على المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة.
المقاومة المكتسبة لمثبطات الهدف الجزيئي هي مشكلة خطيرة في علاج السرطان. ولا يزال سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في معظم البلدان. اكتشاف “طفرات السائق الأنسيجينية”، مثل مستقبلات عاملنمو البشرة (EGFR) – تنشيط الطفرات، والتطور اللاحق للعوامل المستهدفة الجزيئية من مثبطات كيناز التيروزين EGFR (TKIs) (gefitinib، erlotinib، afatinib, dacomitinib, وosimertinib) قد غيرت بشكل كبير علاج سرطان الرئة في العقود الأخيرة. ومع ذلك، لا تزال هذه الأدوية غير فعالة في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) تحمل EGFR-تفعيل الطفرات. بعد المقاومة المكتسبة، لا يزال التقدم المنهجي لNSCLC عقبة كبيرة في علاج المرضى الذين يعانون من الطفرة الإيجابية EGFR NSCLC. هنا، نقدم طريقة تصعيد الجرعة التدريجية لإنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقلة مقاومة للأفاتينيب المكتسبة من خلايا NSCLC PC-9 التي تأوي طفرات EGFR-تفعيل من 15 قاعدة حذف الزوج في EGFR exon 19. يتم عرض طرق لتوصيف خطوط الخلايا الثلاثة المستقلة المقاومة للعفاتينيب لفترة وجيزة. إن آليات المقاومة المكتسبة للمعارف التقليدية في إطار الـ EGFR غير متجانسة. ولذلك، يجب فحص خطوط الخلايا المتعددة التي لها مقاومة مكتسبة للمعارف التقليدية في مصر. هناك حاجة إلى عشرة إلى اثني عشر شهرا للحصول على خطوط الخلايا مع المقاومة المكتسبة باستخدام هذا النهج تصعيد الجرعة stepwise. وسيسهم اكتشاف آليات جديدة للمقاومة المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية أكثر فعالية وأمانا.
خمسة مثبطات كيناز التيروزين, استهداف مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR), بما في ذلك gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, وosimertinib متاحة حاليا لعلاج المرضى الذين يعانون من الطفرة EGFR إيجابية الرئة غير الصغيرة الخلية السرطان (NSCLC). على مدى العقد الماضي، شهدت العلاجات لهؤلاء المرضى تطورا كبيرا مع اكتشاف إمكانات جديدة EGFR-TKIs. بين المرضى الذين يعانون من سرطان الغدة الدرقية في الرئة، يتم تحديد الطفرات الجسدية في EGFR في ما يقرب من 50٪ من الآسيويين و 15٪ من المرضى القوقازيين1. الطفرات الأكثر شيوعا في EGFR هي طفرة نقطة L858R في EGFR exon 21 و 15 زوج قاعدة (BP) الحذف في EGFR exon 192. في المرضى الإيجابية الطفرة EGFR مع NSCLC، EGFR-TKIs تحسين معدلات الاستجابة والنتائج السريرية مقارنة مع المعيار السابق للعلاج الكيميائي البلاتين doublet3.
وكان جيفيتينيب وإرلوتينيب أول مثبطات جزيء صغيرة معتمدة ويشار إليها عموما ً باسم الجيل الأول من المعارف التقليدية غير التقليدية. هذه EGFR TKIs كتلة نشاط كيناز التيروزين من خلال التنافس مع ATP وملزمة عكسها لمواقع الربط ATP4. Afatinib هو الجيل الثاني من EGFR TKI التي ترتبط بشكل لا رجعة فيه وبشكل مشترك إلى مجال كيناز التيروزين من EGFR ويتميز بأنه مثبط الأسرة EGFR عموم الإنسان5.
على الرغم من الفائدة الكبيرة من هذه العلاجات في المرضى الذين يعانون من NSCLC، اكتسبت مقاومة أمر لا مفر منه. آلية المقاومة الأكثر شيوعا ضد الجيل الأول والثاني EGFR TKIs هو ظهور طفرة T790M في EGFR exon 20، وهوموجود في 50-70٪ من عينات الورم 6،7،8. وتشمل آليات المقاومة الأخرى إشارات الالتفافية (إلى MET، IGF1R، وHER2)، والتحول إلى سرطان الرئة الخلية الصغيرة، وتحريض الانتقال الظهاري إلى mesenchymal، والتي تحدث قبل سريريا وسريريا9. إن آليات المقاومة للمعارف التقليدية في إطار القانون الدولي غير متجانسة. من خلال تحديد آليات المقاومة الجديدة في الدراسات ما قبل السريرية، قد يكون من الممكن تطوير علاجات جديدة للتغلب على المقاومة. يجب أن تراعي علاجات التسلسل الأمثل التي تحقق أقصى قدر من الفائدة السريرية للمرضى آليات المقاومة والهدف العلاجي.
لا بد من اختيار خط الخلية الأبوية الصحيح، كما هو أساس جميع التجارب اللاحقة. تبدأ استراتيجيات الاختيار بالأهمية السريرية؛ من الضروري اختيار خط الخلايا السذاجة العلاج الكيميائي والإشعاعي. قد يؤدي العلاج الكيميائي و/أو الإشعاعي السابق إلى تغيير مسارات المقاومة وتغييرات التعبير عن علامات مقاومة الأدوية. في هذه الدراسة، يتم استخدام خلايا PC-9، التي تحمل 15 نقطة أساس الحذف في EGFR exon 19، لإنشاء مقاومة المكتسبة لafatinib. تم اشتقاق هذا الخط الخلوي من مريض ياباني من NSCLC، الذي لم يتلق العلاج الكيميائي والإشعاعي المسبق.
لأن afatinib تدار شفويا على أساس يومي، والعلاج المستمر في المختبر، حيث يتم زراعة الخلايا باستمرار في وجود afatinib ستكون ذات الصلة سريريا. يجب تحسين جرعة الأدوية المستخدمة في مختلف خطوات التجربة لخط الخلية الأبوية المختارة. ويمكن استخدام فحص السمية الخلوية لتحديد مجموعة مناسبة من المخدرات، والتي ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة مع المعلومات الدوائية للدواء.
وطوال عملية الاختيار، يتم الاحتفاظ بمجموع عدد الخلايا كمجموعة واحدة؛ لا يتم استخدام الاستنساخ أو أساليب الفصل الأخرى. تتعرض الخلايا أولا باستمرار إلى مستوى منخفض من المخدرات. في وقت لاحق ، بعد أن تتكيف الخلايا لتنمو في وجود الدواء ، يتم زيادة جرعة الدواء ببطء إلى الجرعة المثلى النهائية من الدواء10،11. بدلا من ذلك، يمكن استخدام نبض إدارة المخدرات أو الطفرات لاختيار خلايا المقاومة، والتي يتم تنفيذها أيضا قبل العلاج من المخدرات 12،13. ولسوء الحظ، لا يتم الإبلاغ عموما عن الحالات التي تفشل فيها مقاومة المخدرات في التطور. يتم تطوير استراتيجيات الاختيار بهدف محاولة تقليد ظروف مرضى السرطان لإعادة بناء المقاومة ذات الصلة سريريا. في بعض الأحيان ، لتحديد التغيرات الجزيئية المرتبطة بآليات مقاومة المخدرات ، يتم استخدام تركيز عالي للأدوية. يصبح هذا النموذج أقل أهمية سريريا.
هنا، ونحن نصف طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب من خلايا PC-9 التي تحتوي على 15 نقطة في الثانية حذف في EGFR exon 19، فضلا عن التوصيف الأولي لخطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب.
هنا، وصفنا طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب وتميزت هذه الخلايا بالمقارنة مع الخلايا الأبوية PC-9. من خلال التعرض لتصعيد الجرعة التدريجية، اكتسبت خلايا PC-9 الأبوية مقاومة لafatinib على مدى فترة 10-12 شهرا. سريريا، آليات المقاومة لEGFR TKIs غير متجانسة، وبالتالي، بعد العلاج ا…
The authors have nothing to disclose.
نشكر عضو معهد أبحاث الترجمة المتقدمة للسرطان على تعليقاته المدروسة وتحريره على مساعدتهم في تحرير اللغة الإنجليزية. وقد دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة: 16K09590 إلى T.Y.).
afatinib | Selleck | S1011 | |
anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
DMSO | Wako | 043-07216 | |
ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
FBS | gibco | 26140-079 | |
GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
TBST powder | sigma | T9039 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
96 well microplate | Thermo | 130188 |