Estabelecimento e caracterização de três linhagens de células PC-9 de adenocarcinoma de pulmão resistentes ao Afatinib desenvolvidas com doses crescentes de Afatinib
Summary
Um método para estabelecer linhas de pilha da afatinib-resistência das pilhas do adenocarcinoma do pulmão PC-9 foi desenvolvido, e as pilhas resistentes foram caracterizadas. As células resistentes podem ser usadas para investigar mecanismos de resistência a inibidores da tirosina quinase do receptor de fator de crescimento epidérmico, aplicáveis para pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.
Abstract
A resistência adquirida aos inibidores do alvo molecular é um problema severo na terapia de cancro. O câncer de pulmão continua sendo a principal causa de morte relacionada ao câncer na maioria dos países. A descoberta de “mutações do condutor oncogênico”, tais como o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)-ativando mutações, e o desenvolvimento subsequente de agentes moleculares alvejados de inibidores da tirosina quinase de EGFR (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib) modificaram dramaticamente o tratamento do cancro do pulmão nas últimas décadas. No entanto, essas drogas ainda não são eficazes em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) portadoras de Mutações ativadoras de EGFR. Após a resistência adquirida, a progressão sistémica do NSCLC continua a ser um obstáculo significativo no tratamento de doentes com CPNPC com mutação EGFR positiva. Aqui, nós apresentamos um método Stepwise do escalonamento de dose para estabelecer três linhas de pilha de afatinib-resistentes adquiridas independentes das pilhas de NSCLC PC-9 que abrigando mutações EGFR-ativando de deleções do par 15-base em EGFR exon 19. Os métodos para caracterizar as três linhas de pilha independentes do afatinib-resistência são apresentados momentaneamente. Os mecanismos de resistência adquiridos aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Conseqüentemente, as linhas de pilha múltiplas com resistência adquirida a EGFR-TKIs devem ser examinadas. Dez a doze meses são exigidos para obter as linhas de pilha com resistência adquirida usando esta aproximação Stepwise da escalada de dose. A descoberta de novos mecanismos de resistência adquiridos contribuirá para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais efetivas e seguras.
Introduction
Cinco inibidores da tirosina quinase, que visam o receptor do fator de crescimento epidérmico (TFGE), incluindo Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib estão atualmente disponíveis para o tratamento de doentes com pulmão de células não pequenas com mutação EGFR cancro (NSCLC). Durante a década passada, as terapias para tais pacientes sofreram o desenvolvimento dramático com a descoberta de EGFR-TKIs novo potencial. Entre os pacientes com adenocarcinoma de pulmão, mutações somáticas na Tfge são identificadas em aproximadamente 50% da Ásia e 15% dos pacientes caucasianos1. As mutações mais comuns no EGFR são uma mutação de ponto L858R em exon EGFR 21 e 15 eliminações de par base (BP) no exon EGFR 192. Em doentes com mutação positiva EGFR com NSCLC, o EGFR-TKIs melhora as taxas de resposta e os resultados clínicos em comparação com o padrão anterior de quimioterapia de dúvida de platina3.
Gefitinib e erlotinib foram os primeiros inibidores da molécula pequena aprovados e são geralmente referidos como TKIs de primeira geração de EGFR. Esses EGFR TKIs bloqueiam a atividade da tirosina quinase competindo com ATP e vinculando reversivelmente a sites de associação de ATP4. O afatinib é um EGFR de segunda geração TKI que se liga irreversivelmente e covalentemente ao domínio da tirosina quinase do EGFR e é caracterizado como um inibidor da família EGFR Pan-humano5.
Apesar do benefício dramatical destas terapias nos pacientes com NSCLC, a resistência adquirida é inevitável. O mecanismo de resistência mais comum contra a EGFR tkis de primeira e segunda geração é o surgimento da mutação T790M no EGFR exon 20, que está presente em 50-70% das amostras tumorais6,7,8. Outros mecanismos de resistência incluem sinais de bypass (para MET, IGF1R e HER2), transformação para câncer de pulmão de pequenas células e indução de transição epitelial-mesenquimais, que ocorrem pré-clinicamente e clinicamente9. Os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Ao identificar novos mecanismos de resistência em estudos pré-clínicos, pode ser possível desenvolver terapêutica inovadora para superar a resistência. As terapias ideais da seqüência que maximizam o benefício clínico aos pacientes devem considerar os mecanismos da resistência e o alvo terapêutico.
É imperativo escolher a linha de célula parental direita, porque é a base de todos os experimentos subseqüentes. As estratégias de seleção começam com relevância clínica; é necessário escolher uma linha celular ingênua de quimioterapia e radiação. O tratamento quimioterapêutico e/ou radiativo prévio pode induzir a alteração de vias de resistência e alterações da expressão de marcadores de resistência a fármacos. Neste estudo, as células PC-9, que transportam 15 deleções BP no exon 19 do EGFR, são empregadas para o estabelecimento de resistência adquirida ao afatinib. Esta linha de pilha foi derivada de um paciente japonês de NSCLC, que não recebesse a quimioterapia e a radiação prévia.
Uma vez que o afatinib é administrado por via oral numa base diária, o tratamento in vitro contínuo, onde as células são cultivadas constantemente na presença de afatinib, seria clinicamente relevante. A dose de medicamentos utilizados nas várias etapas do experimento deve ser otimizada para a linha celular parental selecionada. Um ensaio de citotoxicidade pode ser utilizado para determinar uma gama de fármacos adequado, que deve ser comparável à informação farmacocinética da droga.
Ao longo do processo de seleção, toda a população de células é mantida como um único grupo; clonagem ou outros métodos de separação não são utilizados. As células são primeiro continuamente expostos a um baixo nível da droga. Subseqüentemente, depois que as pilhas se adaptarem para crescer na presença da droga, a dose da droga é aumentada lentamente à dose óptima final da medicina10,11. Alternativamente, um pulso de administração de drogas ou mutagenese pode ser usado para a seleção de células de resistência, que também são realizadas antes do tratamento medicamentoso 12,13. Infelizmente, casos em que a resistência à droga não se desenvolve geralmente não são relatados. As estratégias de seleção são desenvolvidas com o objetivo de tentar imitar as condições dos pacientes oncológicos para reconstruir a resistência clinicamente relevante. Às vezes, para identificar alterações moleculares associadas a mecanismos de resistência a fármacos, é utilizada uma alta concentração de fármacos. Este modelo torna-se menos clinicamente relevante.
Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independente afatinib-resistentes das pilhas PC-9 que abrigando deleções de 15 BP no exon 19 de EGFR assim como a caracterização inicial das linhas de pilha afatinib-resistentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independentes do afatinib-resistentes e caracterizamos estas pilhas por comparação às pilhas PC-9 parentais. Por exposição Stepwise da escalada de dose, as pilhas PC-9 parentais adquiriram a resistência ao afatinib durante um período de 10-12 meses. Clinicamente, os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos e, portanto, após o tratamento inicial com afatinib, as células PC-9 foram divididas em três pratos P100 independ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao membro do Instituto avançado de pesquisa translacional de câncer por seus comentários pensativos e Editage para sua assistência com a edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (número da subvenção: 16K09590 a
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
