Établissement et caractérisation de trois lignées cellulaires résistantes à l'adénocarciane pulmonaire résistante à l'afatinib PC-9 développées avec des doses croissantes d'Afatinib
Summary
Une méthode pour établir des lignes cellulaires afatinib-résistance des cellules PC-9 d’adénocarcinome de poumon a été développée, et des cellules résistantes ont été caractérisées. Les cellules résistantes peuvent être employées pour étudier les mécanismes épidermiques de récepteur de kinase de kinase de facteur de croissance de facteur de facteur de tyrosine, applicables pour des patients présentant le cancer du poumon de non-petite cellule.
Abstract
La résistance acquise aux inhibiteurs moléculaires de cible est un problème grave dans la thérapie de cancer. Le cancer du poumon demeure la principale cause de décès liés au cancer dans la plupart des pays. La découverte de « mutations de conducteur oncogènes »,telles que les mutations épidermiques de facteur de croissance (EGFR) activant, et le développement suivant des agents moléculaires ciblés des inhibiteurs de la kinase de tyrosine d’EGFR (TKIs) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, et osimertinib) ont considérablement modifié le traitement du cancer du poumon au cours des dernières décennies. Cependant, ces médicaments ne sont toujours pas efficaces chez les patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) porteurs de mutations activantes EGFR. Après résistance acquise, la progression systémique de NSCLC demeure un obstacle significatif en traitant des patients présentant le NSCLC mutation-positif d’EGFR. Ici, nous présentons une méthode progressive d’escalade de dose pour établir trois lignées cellulaires afatinib-résistantes acquises indépendantes des cellules PC-9 de NSCLC hébergeant des mutations EGFR-activant des suppressions de paire s’édifiantdansdansdans eegFR exon 19. Des méthodes pour caractériser les trois lignées cellulaires indépendantes d’afatinib-résistance sont brièvement présentées. Les mécanismes de résistance acquis aux TCI EGFR sont hétérogènes. Par conséquent, plusieurs lignées cellulaires ayant une résistance acquise à l’EGFR-TKIs doivent être examinées. Dix à douze mois sont nécessaires pour obtenir des lignées cellulaires avec une résistance acquise en utilisant cette approche d’escalade de dose progressive. La découverte de nouveaux mécanismes de résistance acquis contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques plus efficaces et plus sûres.
Introduction
Cinq inhibiteurs de la tyrosine kinase, ciblant le récepteur épidermique du facteur de croissance (EGFR), y compris le gefitinib, l’erlotinib, l’afatinib, le dacomitinib et l’osimertinib sont actuellement disponibles pour traiter les patients atteints de poumon non à petites cellules non à petites cellules mutation EGFR cancer (NSCLC). Au cours de la dernière décennie, les thérapies pour de tels patients ont subi le développement dramatique avec la découverte de nouveaux EGFR-TKIs potentiels. Parmi les patients atteints d’adénocarcinome pulmonaire, des mutations somatiques dans l’EGFR sont identifiées chez environ 50 % des patients asiatiques et 15 % des patients caucasiens1. Les mutations les plus communes dans EGFR sont une mutation de point de L858R dans egFR exon 21 et 15 suppressions de paire de base (bp) dans l’exon d’EGFR 192. Chez les patients egFR mutation-positifs avec NSCLC, EGFR-TKIs améliorer les taux de réponse et les résultats cliniques par rapport à la norme précédente de la chimiothérapie de doublet de platine3.
Le gefitinib et l’erlotinib ont été les premiers inhibiteurs approuvés de petites molécules et sont généralement appelés TKIs EGFR de première génération. Ces EGFR TKIs bloquent l’activité tyrosine kinase en rivalisant avec l’ATP et en se liant de manière réversible aux sites de liaison ATP4. Afatinib est un TKI EGFR de deuxième génération qui se lie de façon irréversible et covalente au domaine de la tyrosine kinase de l’EGFR et se caractérise comme un inhibiteur panhumain de la famille EGFR5.
En dépit de l’avantage dramatique de ces thérapies dans les patients présentant NSCLC, la résistance acquise est inévitable. Le mécanisme de résistance le plus commun contre les TKIs EGFR de première et deuxième génération est l’émergence de la mutation T790M dans l’exon 20 d’EGFR, qui est présent dans 50-70% des échantillons de tumeur6,7,8. D’autres mécanismes de résistance incluent des signaux de déviation (au MET, à l’IGF1R, et au HER2), la transformation au cancer dupoumon à petites cellules, et l’induction de la transition épithéliale-à-mesenchymal, qui se produisent précliniquement et médicalement 9. Les mécanismes de résistance aux TCI EGFR sont hétérogènes. En identifiant de nouveaux mécanismes de résistance dans les études précliniques, il peut être possible de développer de nouvelles thérapies pour surmonter la résistance. Les thérapies optimales de séquence qui maximisent l’avantage clinique aux patients doivent considérer les mécanismes de résistance et la cible thérapeutique.
Il est impératif de choisir la bonne lignée cellulaire parentale, car c’est la base de toutes les expériences ultérieures. Les stratégies de sélection commencent par une pertinence clinique; il est nécessaire de choisir une ligne cellulaire naïve de chimiothérapie et de rayonnement. Le traitement chimiothérapeutique et/ou radiatif antérieur peut induire l’altération des voies de résistance et les changements de l’expression des marqueurs de résistance aux médicaments. Dans cette étude, les cellules PC-9, portant des suppressions de 15 bp dans egFR exon 19, sont employées pour l’établissement de la résistance acquise à l’afatinib. Cette lignée cellulaire a été dérivée d’un patient japonais de NSCLC, qui n’a pas reçu la chimiothérapie et le rayonnement antérieurs.
Parce que l’afatinib est administré par voie orale sur une base quotidienne, le traitement in vitro continu, où les cellules sont cultivées en permanence en présence d’afatinib serait cliniquement pertinent. La dose de médicaments utilisés dans les différentes étapes de l’expérience doit être optimisée pour la lignée cellulaire parentale sélectionnée. Un test de cytotoxicité peut être utilisé pour déterminer une gamme de médicaments approprié, qui devrait être comparable à l’information pharmacocinétique du médicament.
Tout au long du processus de sélection, toute la population de cellules est maintenue en un seul groupe; le clonage ou d’autres méthodes de séparation ne sont pas utilisés. Les cellules sont d’abord continuellement exposées à un faible niveau de la drogue. Par la suite, après que les cellules s’adaptent pour se développer en présence du médicament, la dose du médicament est lentement augmentée à la dose optimale finale du médicament10,11. Alternativement, une administration de drogue de pouls ou mutagénèse peut être employée pour sélectionner des cellules de résistance, qui sont également exécutées avant le traitement de drogue 12,13. Malheureusement, les cas où la résistance aux médicaments ne se développe pas ne sont généralement pas signalés. Les stratégies de sélection sont développées dans le but d’essayer d’imiter les conditions des patients cancéreux pour reconstruire la résistance médicalement pertinente. Parfois, pour identifier les changements moléculaires associés aux mécanismes de résistance aux médicaments, une forte concentration de médicaments est utilisée. Ce modèle devient moins pertinent sur le plan clinique.
Ici, nous décrivons une méthode pour établir trois lignées cellulaires indépendantes afatinib-résistantes des cellules DE PC-9 abritant 15 suppressions de bp dans l’exon 19 d’EGFR aussi bien que la caractérisation initiale des lignes cellulaires afatinib-résistantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode pour établir trois lignées cellulaires indépendantes résistantes à l’afatinib et caractérisé ces cellules par rapport aux cellules PC-9 parentales. Par l’exposition progressive d’escalade de dose, les cellules parentales de PC-9 ont acquis la résistance à l’afatinib sur une période de 10-12 mois. Cliniquement, les mécanismes de résistance aux ItNI EGFR sont hétérogènes, et donc, après le traitement initial avec l’afatinib, les cellules PC-9 ont été divisées en trois…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le membre de l’Institut avancé de recherche translationnelle sur le cancer pour ses commentaires réfléchis et son édition pour son aide à l’édition de la langue anglaise. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (numéro de subvention: 16K09590 à T.Y.).
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
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