Istituzione e caratterizzazione di tre linee cellulari adenocarcinoma polmonare resistente agli Agrassiinib sviluppate con l'aumento delle dosi di Afatinib
Summary
È stato sviluppato un metodo per stabilire linee cellulari aresistenza ai grassiinib da cellule adenocarcinoma polmonari PC-9, e sono state caratterizzate cellule resistenti. Le cellule resistenti possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza dell’inibitore della cinesi del fattore di crescita epidermico, applicabili per i pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule.
Abstract
La resistenza acquisita agli inibitori molecolari è un grave problema nella terapia del cancro. Il cancro del polmone rimane la principale causa di morte per cancro nella maggior parte dei paesi. La scoperta di “mutazioni del driver oncogeniche”, come il recettore del fattore di crescita epidermico(EGFR) e il successivo sviluppo di agenti molecolari mirati della licinesi (TCI) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, e osimertinib) hanno drammaticamente alterato il trattamento del cancro ai polmoni negli ultimi decenni. Tuttavia, questi farmaci non sono ancora efficaci nei pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole (NSCLC) che trasportano mutazioni attivanti EGFR. A seguito della resistenza acquisita, la progressione sistemica della NSCLC rimane un ostacolo significativo nel trattamento dei pazienti con NSCLC positivo alla mutazione EGFR. Qui, presentiamo un metodo di escalation delle dosi graduale per stabilire tre linee cellulari agrassinib agrassiinib acquisite in modo indipendente da cellule NSCLC PC-9 che ospitano mutazioni di commutazione di coppie di 15 basi in EGFR esoni 19. Vengono brevemente presentati metodi per caratterizzare le tre linee cellulari indipendenti aresistenza agrassiinib. I meccanismi di resistenza acquisiti alle EGFR TCI sono eterogenei. Pertanto, devono essere esaminate più linee cellulari con resistenza acquisita agli EGFR-TCI. Da dieci a dodici mesi sono necessari per ottenere linee cellulari con resistenza acquisita utilizzando questo approccio di escalation della dose stepwise. La scoperta di nuovi meccanismi di resistenza acquisiti contribuirà allo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci e sicure.
Introduction
Cinque inibitori della kinasi tirosina, mirati al recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), tra cui gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib sono attualmente disponibili per il trattamento di pazienti con cancro (NSCLC). Negli ultimi dieci anni, le terapie per tali pazienti hanno subito uno sviluppo drammatico con la scoperta di nuovi potenziali EGFR-TMI. Tra i pazienti con adenocarcinoma polmonare, le mutazioni somatiche nell’EGFR sono identificate in circa il 50% dei pazienti asiatici e il 15% dei pazienti caucasici1. Le mutazioni più comuni in EGFR sono una mutazione punto L858R in EGFR exon 21 e 15 coppie di base (bp) delezioni in EGFR exon 192. Nei pazienti eGFR con NSCLC, gli EGFR-TMI migliorano i tassi di risposta e gli esiti clinici rispetto al precedente standard di chemioterapia del doppietto di platino3.
Gefitinib e erlotinib sono stati i primi inibitori di piccole molecole approvati e sono generalmente indicati come TCI EGFR di prima generazione. Questi EGFR TKIs bloccano l’attività della chinasi della tirosina competendo con ATP e legandosi reversibilmente ai siti di legame ATP4. Afatinib è un EGFR TKI di seconda generazione che si lega in modo irreversibile e covalente al dominio della chinasi tirosina di EGFR ed è caratterizzato come un inibitore della famiglia EGFR pan-umano5.
Nonostante il vantaggio drammatico di queste terapie nei pazienti con NSCLC, la resistenza acquisita è inevitabile. Il meccanismo di resistenza più comune contro i TCI EGFR di prima e seconda generazione è l’emergere della mutazione T790M in EGFR exon 20, che è presente nel 50-70% dei campioni di tumore6,7,8. Altri meccanismi di resistenza includono segnali di bypass (a MET, IGF1R, e HER2), trasformazione in carcinoma polmonare a piccole cellule, e l’induzione di transizione epiteliale-mesenchymal, che si verificano pre-clinicamente e clinicamente9. I meccanismi di resistenza alle EGFR TCI sono eterogenei. Identificando nuovi meccanismi di resistenza negli studi preclinici, potrebbe essere possibile sviluppare nuove terapie per superare la resistenza. Le terapie di sequenza ottimali che massimizzano il beneficio clinico per i pazienti devono considerare i meccanismi di resistenza e l’obiettivo terapeutico.
È imperativo scegliere la giusta linea cellulare dei genitori, in quanto è la base di tutti gli esperimenti successivi. Le strategie di selezione iniziano con rilevanza clinica; è necessario scegliere una linea cellulare chemioterapia e radioattiva. Il precedente trattamento chemioterapico e/o radiativo può indurre l’alterazione delle vie di resistenza e cambiamenti dell’espressione dei marcatori di resistenza ai farmaci. In questo studio, le cellule PC-9, che trasportano 15 bp delezioni in EGFR exon 19, sono impiegate per l’istituzione di resistenza acquisita all’afatinib. Questa linea cellulare è stata derivata da un paziente NSCLC giapponese, che non ha ricevuto chemioterapia e radiazioni precedenti.
Poiché afatinib viene somministrato per via orale su base giornaliera, il trattamento continuo in vitro, in cui le cellule vengono coltivate costantemente in presenza di afatinib sarebbe clinicamente rilevante. La dose di droghe utilizzate nelle varie fasi dell’esperimento deve essere ottimizzata per la linea cellulare dei genitori selezionata. Un saggio di citotossicità può essere utilizzato per determinare una gamma di farmaci adatti, che dovrebbe essere paragonabile alle informazioni farmacocinetiche del farmaco.
Durante tutto il processo di selezione, l’intera popolazione di cellule viene mantenuta come un unico gruppo; la clonazione o altri metodi di separazione non vengono utilizzati. Le cellule sono prima continuamente esposte a un basso livello del farmaco. Successivamente, dopo che le cellule si adattano a crescere in presenza del farmaco, la dose del farmaco viene lentamente aumentata alla dose ottimale finale del farmaco10,11. In alternativa, un impulso farmaco-somministrazione o mutagenesi può essere utilizzato per la selezione di cellule di resistenza, che vengono eseguite anche prima del trattamento farmacologico 12,13. Purtroppo, i casi in cui la resistenza ai farmaci non si sviluppa sono generalmente segnalati. Le strategie di selezione sono sviluppate con l’obiettivo di cercare di imitare le condizioni dei pazienti oncologici per ricostruire la resistenza clinicamente rilevante. A volte, per identificare i cambiamenti molecolari associati ai meccanismi di resistenza ai farmaci, viene utilizzata un’alta concentrazione di farmaci. Questo modello diventa meno clinicamente rilevante.
Qui, descriviamo un metodo per stabilire tre linee cellulari indipendenti resistenti agli agrassinib da cellule PC-9 che ospitano 15 bp delezioni in EGFR exon 19, nonché la caratterizzazione iniziale delle linee cellulari resistenti agli agrassiinib.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un metodo per stabilire tre linee cellulari indipendenti resistenti agli agrassinib e abbiamo caratterizzato queste cellule rispetto alle cellule parentali del PC-9. Con l’esposizione all’escalation della dose graduale, le cellule parentali di PC-9 hanno acquisito resistenza all’afatinib per un periodo di 10-12 mesi. Clinicamente, i meccanismi di resistenza ai TCI EGFR sono eterogenei, e quindi, dopo il trattamento iniziale con afatinib, le cellule PC-9 sono state suddivise in tre piatti p100 indip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il membro dell’Advanced Cancer Translational Research Institute per i loro commenti premurosi e Editage per la loro assistenza con l’editing in lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione: 16K09590 a T.Y.).
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
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