Текущий протокол описывает комплексный метод исследования миграции клеток рака и вторжения на единой платформе в режиме реального времени, обеспечивая легко воспроизводимые и время эффективный вариант для изучения клеток мобильность и морфологии.
Рак клеток мобильность имеет решающее значение для начала метастазов. Таким образом исследование клеточного движения и инвазивного потенциала имеет большое значение. Анализов миграции обеспечивают основные понимание клеточного движения на 2D уровне, тогда как вторжения анализов более физиологически важны, подражая в естественных условиях раковых клеток выскальзывание из оригинального сайта и вторжение через внеклеточного матрикса. Текущий протокол обеспечивает один рабочий процесс для миграции и вторжения анализов. Вместе с комплексной автоматизированной микроскопических камеры для реального времени изображения HD и модуль встроенного анализа это дает исследователи время эффективный, простой и воспроизводимые экспериментальный вариант. Этот протокол также включает замены расходных материалов и методов альтернативного анализа для пользователей, чтобы выбрать из.
Миграции клеток и вторжения являются важные биологические процессы, которые позволяют нормальных функций в теле человека, таких, как закрытие раны, вторжение плаценты в матки и молочной железы морфогенеза1,2,3. Человеческое тело имеет точного и строгого контроля этих биологических событий; Однако есть некоторые исключения. Злокачественные опухоли, например, возможность избежать этой гарантии, демонстрируют ненормальное распространения и вторгнуться в соседние ткани, которая называется метастазированием. Метастазирование является главной причиной смертности, связанной с раком4.
Рак молочной железы является наиболее часто диагноз рака у женщин и является вторым по величине причиной связанных с раком смерти среди женщин в развитых странах во всем мире5. Рак молочной железы происходит от протоки или долек, которые состоят из одного или нескольких слоев эпителиальных клеток. В нормальной груди эпителиальные клетки придерживаться друг с другом и базальной мембраны через мембранных белков, таких как E-Кадгерины и интегринов6. Однако инвазивным молочной железы клетки рака потеряли их полярность и клеток клеточной адгезии и классически пройти переходного эпителия мезенхимы (EMT) и получить возможность перемещения. После кровоподтек эти клетки пересекают внеклеточного матрикса (ECM) и введите кровеносного сосуда или лимфатической системы, затем следуют intravasation и метастатические роста7. Понимание механизмов, посредством которых это происходит, имеет большое значение, поскольку метастаз является наиболее распространенной причиной смертности, связанных с раком и тесно связана с раком клетки миграции/вторжения. Чтобы визуализировать движение раковых клеток, миграции и вторжения анализов являются идеальной модели для изучения 2D и 3D клеточного движения, соответственно. Миграции непосредственно оценивает движение клеток, тогда как вторжения включает в себя взаимодействие с микроокружения и способность к разложению биологические барьеры. Эти два процесса не являются полностью независимыми друг от друга, как миграция является требованием вторжения.
Несколько методов были разработаны для изучения миграции и вторжения. Как рассмотрено, Крамер et al., анализов миграции как ранозаживляющее, забор и микро перевозчик анализов генерировать клетки свободно OBLASTь разрешить клетки переехать в, оценка изменения площади; в то время как transwell и капиллярной анализы основаны на количество клеток, которые двигаться в сторону аттрактанта8. Для вторжения анализов, ECM среды должен быть установлен с ECM гель или коллагена например, и 3D движения могут быть оценены путем наблюдения за вторжения области, расстояние и клеток обвинения (например, transwell проба, Утконос пробирного)8. Другой тип вторжения пробирного является объединить инвазивных клетки с неинвазивные клеток и оценить поведение инвазивных клеток (например, assays сфероида). Эти методы имеют свои плюсы и минусы и путь, это простой подход, легко повторить и объединить assay переноса и пробирного вторжения в рабочем процессе подобных преференций в экспериментальный дизайн.
Этот протокол описывает измерение миграции клеток и вторжения, с помощью томографа живой клетки. Это реальном времени ячейки, мониторинга системы, установленной в инкубатор культуры стандартной ячейки. Он принимает изображения высокой четкости согласно сканирование интервалы и измерения, применяя соответствующие маски в клетки или флуоресцентные целей. Модуль миграции/вторжения пробирного включает в себя использование 96-контактный скретч инструмент, который подходит для создания однородной скретч раны на монослое клеток в 96-луночных пластине. Этот механизм основан на в пробирке рану исцеление анализов, мониторинг 2D клеточного движения на пластиковом или с покрытием поверхности. Можно также оценить вторжения или 3D движение через дополнительные ECM в пределах нуля раны. Краткий рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1.
Миграция и вторжения являются важными параметрами для оценки подвижности раковых клеток. Используя инструмент скретч 96-pin, это возможно для проведения анализов в 2D и 3D ранозаживляющее одновременно. Помимо содействия автоматическое сканирование, обеспечение стабильной клетки культур?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы отметить нашу финансовую поддержку Фонда группы Блумфилд через охотник медицинский научно-исследовательский институт (КЖДИ 13-02). X.Z поддерживается АПА стипендии через университета Ньюкасла и HCRA биомаркеров флагман PhD стипендии.
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |