זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים
Summary
בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.
Abstract
סרטן התא ניידות חיונית אתחול של גרורות. לכן, חקירה של תנועת התא, קיבולת פולשנית היא משמעות רבה. העברת מבחני לספק תובנה בסיסית של תנועת התא ברמה 2D, ואילו מבחני הפלישה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, מחקה סרטן ויוו dislodgment תא מהאתר המקורי, פולשים באמצעות מטריצות. בפרוטוקול הנוכחי מספק זרימת עבודה יחידה עבור מבחני ההעברה ואת הפלישה. יחד עם משולב אוטומטי מיקרוסקופיים המצלמה עבור ניתוח מובנה מודול ותמונות בזמן אמת HD, זה נותן חוקרים היעילה, האפשרות ניסיוני פשוטה לשחזור. פרוטוקול זה כולל גם החלפות הגיוניות מתכלים ושיטות ניתוח חלופי עבור משתמשים לבחירה.
Introduction
נדידת תאים הפלישה חשוב תהליכים ביולוגיים המאפשרים פונקציות נורמלית בגוף האדם, כגון סגירת הפצע, הפלישה של השליה לתוך הרחם ואת עטין מורפוגנזה1,2,3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בגוף האדם יש שליטה קפדני ומדויק של אירועים אלה ביולוגי; עם זאת, ישנם כמה חריגים. גידולים ממאירים, למשל, מסוגלים לברוח הגנה זו, מוצג התפשטות חריגה, לפלוש לתוך רקמות שכנות, אשר נקרא גרורות. גרורות הוא הגורם העיקרי של תמותה מסרטן4.
סרטן השד הוא הכי נפוץ אובחן סרטן אצל נשים, הוא הגורם השני-הגבוה של מוות מסרטן בקרב נשים במדינות מפותחות ברחבי העולם5. סרטן השד מקורו של צינוריות או האוניות המורכבים של שכבה אחת או יותר של תאים אפיתל. בשד נורמלי, תאים אפיתל לדבוק אחד לשני וכדי קרום המרתף דרך הממברנה חלבונים כגון E-קדהרין אינטגרינים6. עם זאת, תאי סרטן שד פולשני איבדו קוטביות והצמדות התא-התא שלהם, ולא בסגנון קלאסי עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) ולהשיג את היכולת לנוע. לאחר extravasation, תאים אלה תנוע מטריצה חוץ-תאית (ECM) והזן את כלי הדם או מערכת הלימפה, ואחריו ואז intravasation וגידול גרורתי7. הבנת המנגנונים שבאמצעותו זו מתרחשת היא משמעות רבה, מאז גרורות הוא הגורם הנפוץ ביותר הקשורים לסרטן בהירושימה, קשורה קשר הדוק סרטן תא העברה/הפלישה. כדי להמחיש את התנועה של תאים סרטניים, מבחני ההעברה ופלישה הם מודלים אידיאלי ללמוד 2D and 3D תנועת התא, בהתאמה. העברה ישירות מעריך את התנועה של תאי ואילו הפלישה ושכוללת מגע עם microenvironment ואת היכולת לבזות את המחסומים הביולוגיים. שני התהליכים אינם עצמאית לחלוטין של זה, כמו הגירה היא דרישה של פלישה.
פותחו מספר שיטות ללמוד הגירה ו הפלישה. כפי שנבדקו על ידי קרמר ואח ‘, העברת מבחני כגון ריפוי הפצע, גדר, מיקרו-המוביל מבחני ליצור אזור נטול תאים כדי לאפשר תאים להעביר, הערכת השינוי של אזור; ואילו, מבחני transwell ו נימי מבוססים על מספר התאים שנעים לכיוון attractant8. מבחני הפלישה, סביבה ECM צריך להיות מוגדרת עם ג’ל ECM או קולגן למשל, התנועה 3D יכול להיות מוערך על ידי ניטור הפלישה פינת, מרחק, תא הסעיפים (למשל assay transwell, ברווזן assay)8. סוג נוסף של הפלישה assay היא לשלב את התאים פולשנית עם תאים לא פולשנית, להעריך את ההתנהגות של התאים פולשני (למשל, מבחני ספרואיד). השיטות שהוזכרו לעיל יש את היתרונות שלהם, אסירים, דרך קלה לגישה, קל לחזור על, שילוב וזמינותו ההעברה והיא הפלישה assay בזרימת עבודה דומה מועדף בעיצוב ניסיוני.
פרוטוקול זה מתאר את המדידה של נדידת תאים ופלישה באמצעות imager לחיות תאים. . זה תא בזמן אמת ניטור מערכת המותקנת בתוך חממה התרבות תאים סטנדרטית. זה לוקח תמונות בחדות גבוהה לפי ערכת סריקה במרווחי זמן ומדידות על-ידי החלת מסיכות מתאימות התאים או מטרות פלורסנט. המודול של העברה/הפלישה assay כולל באמצעות כלי גירוד 96 פינים, אשר מתאים לייצור הומוגניות לגרד פצעים על טפט התא בצלחת 96-ובכן. המנגנון מבוסס על הפצע במבחנה ריפוי מבחני, ניטור תנועת התא 2D פלסטיק או משטח מצופה. הפלישה או תלת-ממד התנועה מעבר ECM נוספים בתוך השריטה פצע יכול גם להיות מוערך. זרימת עבודה קצרה מודגם באיור1.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההעברה הפלישה פרמטרים חשובים כדי להעריך את הניידות של תאי הסרטן בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. על-ידי שימוש בכלי גירוד 96 פינים, זה אפשרי לערוך ריפוי מבחני ב 2D and 3D בו זמנית הפצע. מלבד בהנחיה בסריקה אוטומטית באמצעות סביבת התרבות התא יציב עם הפרעה מינימלית, וזמינותו מאפס נערך באמצעות הכלי מאפס …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות תמיכתנו מימון על ידי קרן קבוצת בלומפילד דרך צייד המכון למחקר רפואי (HMRI 13-02). X.Z נתמך על ידי מלגת APA דרך האוניברסיטה של ניוקאסל את המלגה לתואר שלישי HCRA הדגל סמנים ביולוגיים.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
