Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager
Summary
Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.
Abstract
Kanker cel mobiliteit is cruciaal voor de opening van metastase. Onderzoek van de cel beweging en invasieve capaciteit is daarom van groot belang. Migratie testen bieden fundamenteel inzicht van cel verkeer op een 2D-niveau, overwegende dat de invasie testen zijn meer fysiologisch relevant, het nabootsen van in vivo kanker cel dislodgment van de oorspronkelijke site en invasie via de extracellulaire matrix. Het huidige protocol biedt een enkele workflow voor migratie en invasie testen. Samen met de geïntegreerde automatische microscopische camera voor real-time HD-beelden en ingebouwde analyse module geeft het onderzoekers een tijd-efficiënte, eenvoudige en reproduceerbare experimentele optie. Dit protocol omvat ook vervangingen voor de verbruiksartikelen en alternatieve analysemethoden voor gebruikers om uit te kiezen.
Introduction
Cel migratie en invasie zijn belangrijke biologische processen waarmee normale functies in het menselijk lichaam, zoals wond sluiting, invasie van placenta in de baarmoeder en de borstklieren morfogenese1,2,3. Het menselijk lichaam heeft precieze en strikte controle van deze biologische gebeurtenissen; Er zijn echter enkele uitzonderingen. Tumoren, zijn bijvoorbeeld in staat om te ontsnappen aan deze beveiliging, exposeren van abnormale proliferatie en binnenvallen in naburige weefsel, die metastase heet. Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker verband houdende mortaliteit4.
Borstkanker is de meest algemeen diagnose van kanker bij vrouwen, en is de tweede hoogste oorzaak van kanker sterfgevallen onder vrouwen in ontwikkelde landen wereldwijd5. Borstkanker is afkomstig van leidingen of melkklieren die bestaan uit een of meer lagen van epitheliale cellen. In de normale borst houden de epitheliale cellen aan elkaar en aan het membraan van de kelder door membraaneiwitten zoals E-cadherine en integrins6. Echter, invasieve borstkankercellen hebben verloren hun polariteit en cel-cel adhesie, klassiek ondergaan epitheliale mesenchymale overgang (EMT) en krijgen de mogelijkheid om te verplaatsen. Na extravasation, deze cellen bewegen over de extracellulaire matrix (ECM) en voer het bloedvat of het lymfestelsel, dan gevolgd door intravasation en metastatische groei7. Inzicht in de mechanismen waarmee dit gebeurt is van groot belang, aangezien metastase de meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte is en nauw aan kanker verwant is cel migratie/invasie. Om te visualiseren het verkeer van kankercellen, zijn migratie en invasie testen ideale modellen te bestuderen van 2D- en 3D-beweging van de cel, respectievelijk. Migratie beoordeelt rechtstreeks de beweging van de cellen overwegende dat invasie interactie met de communicatie en het vermogen vereist om degraderen biologische barrières. De twee processen zijn niet volledig onafhankelijk van elkaar, zoals migratie een eis van de invasie is.
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van migratie en invasie. Als herzien door Kramer et al., migratie testen zoals de wondgenezing, hek en micro-carrier vitrotests genereren een cel-vrije zone zodat cellen verplaatsen naar, beoordeling van de verandering van ruimte; Overwegende dat, met het testen van transwell en capillair zijn gebaseerd op het aantal cellen dat bewegen in de richting een lokstof8. Voor invasie testen, heeft een ECM-omgeving worden opgezet met ECM gel of collageen bijvoorbeeld, en 3D-beweging kan worden geëvalueerd door het toezicht op de invasie gebied, afstand en cel graven (bijvoorbeeld transwell-assay, platypus assay)8. Een ander soort invasie assay is het combineren van de invasieve cellen met niet-invasieve cellen en beoordelen van het gedrag van de invasieve cellen (bijvoorbeeld sferoïde testen). De bovenstaande methoden hebben hun voors en tegens, en een manier die gemakkelijk te aanpak, gemakkelijk te herhalen en te combineren van de bepaling van de migratie en invasie assay in een soortgelijke werkstroom is preferentieel proefopzet.
Dit protocol beschrijft de meting van cel migratie en invasie met behulp van een live-cel imager. Het is een real-time cel bewakingssysteem geïnstalleerd in een standaard cel cultuur incubator. Duurt het high definition-beelden volgens de set scannen intervallen en metingen door passende maskers toe te passen aan de cellen of fluorescerende doelen. De module van migratie/invasie bepaling bevat gereedschap 96-pins kras, die geschikt is voor het maken van homogene kras wonden op een cel enkelgelaagde in een 96-wells-plaat. Het mechanisme is gebaseerd op in vitro wond genezing testen, monitoring van 2D cel verkeer op een plastic of gecoate oppervlak. Invasie of 3D-beweging over een extra ECM binnen de kras wond kan ook worden beoordeeld. Een korte workflow wordt geïllustreerd in Figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migratie en invasie zijn belangrijke parameters voor de beoordeling van de mobiliteit van kankercellen. Met behulp van de 96-pins kras tool, is het mogelijk om uit te voeren van de wond genezing testen in 2D en 3D gelijktijdig. Naast het vergemakkelijken van automatisch scannen, een stabiele cel cultuur omgeving met minimale verstoring, de kras bepaling uitgevoerd met gebruikmaking van de 96-pins kras tool biedt consistente kras wonden, inschakelen van experimenten die robuuster en reproduceerbaar. De 96-wells-plaat form…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Graag willen we erkennen onze financiële steun door de Bloomfield Groep Foundation via het Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z wordt ondersteund door een APA-beurs door de Universiteit van Newcastle en de HCRA Biomarkers vlaggenschip PhD Scholarship.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
