使用自动活单元成像仪的简单迁移/入侵工作流
Summary
目前的协议描述了一种实时研究癌症细胞迁移和入侵的综合方法, 为研究细胞迁移和形态提供了一个易于重现和省时的选择。
Abstract
癌细胞的移动性是开始转移的关键。因此, 对细胞运动和侵入能力的调查具有重要意义。迁移检测提供了2d 水平细胞运动的基本见解, 而入侵检测在生理上更相关, 在体内模拟体内癌细胞从原始部位脱落, 并通过细胞外基质入侵。当前协议为迁移和入侵检测提供了一个单一的工作流。与用于实时高清图像的集成自动化显微镜相机和内置分析模块相结合, 它为研究人员提供了一个省时、简单且可重复的实验选项。该协议还包括耗材的替换和供用户选择的替代分析方法。
Introduction
细胞迁移和侵袭是使人体正常功能的重要生物过程, 如伤口闭合、胎盘侵入子宫和乳腺形态发生1,2,3。人体对这些生物事件有精确而严格的控制;但是, 也有一些例外。恶性肿瘤, 例如, 能够逃脱这种保护, 表现出异常增殖, 并侵入邻近组织, 这被称为转移。转移是导致癌症相关死亡的主要原因4。
乳腺癌是妇女最常见的癌症, 也是全世界发达国家妇女癌症相关死亡的第二大原因5。乳腺癌起源于由一个或多个上皮细胞层组成的导管或小叶。在正常乳房中, 上皮细胞通过膜蛋白 (如 e-钙粘蛋白和整合素 6) 相互粘附并粘附到基底膜上。然而, 浸润性乳腺癌细胞已经失去了极性和细胞粘附, 并经典地进行上皮间充质转变 (emt), 并获得移动能力。外渗后, 这些细胞在细胞外基质 (ecm) 上移动, 进入血管或淋巴系统, 然后是静脉内和转移生长7。了解这种情况发生的机制具有重要意义, 因为转移是癌症相关死亡的最常见原因, 与癌细胞迁移/浸润密切相关。为了想象癌细胞的运动, 迁移和入侵检测是研究二维和三维细胞运动的理想模型。迁移直接评估细胞的运动, 而入侵则涉及与微环境的相互作用和降解生物屏障的能力。这两个过程并不完全独立, 因为移徙是入侵的要求。
研究移民和入侵的方法有几种。根据 kramer 等人的评论, 移情检测, 如伤口愈合, 围栏和微载体检测产生一个无细胞的区域, 使细胞进入, 评估区域的变化;然而, 经井和毛细血管检测是基于向吸引物8移动的细胞数量。例如, 对于入侵检测, 必须使用 ecm 凝胶或胶原蛋白建立 ecm 环境, 并可通过监测入侵区域、距离和细胞计数 (如转井检测、鸭排检测)来评估3d 运动。另一种类型的入侵检测是将浸润性细胞与非侵入性细胞结合起来, 并评估浸润细胞的行为 (例如球体检测)。上述方法有其优缺点, 在相似的工作流程中, 一种易于接近、易于重复、并在相似工作流程中结合迁移分析和入侵分析的方法是有利的。
该协议描述了使用活细胞成像仪测量细胞迁移和入侵的方法。它是安装在标准细胞培养孵化器中的实时细胞监测系统。它通过对细胞或荧光目标应用适当的掩模, 根据设定的扫描间隔和测量方法拍摄高清晰度图像。迁移/入侵检测模块包括使用96针划伤工具, 该工具适用于在96孔板的细胞单层上制造均匀的划痕伤。该机制基于体外伤口愈合检测, 监测塑料或涂层表面的2d 细胞运动。还可以评估划伤伤口内其他 ecm 的入侵或3d 运动。图 1显示了一个简短的工作流。
Protocol
Representative Results
Discussion
迁移和入侵是评估癌细胞流动性的重要参数。通过使用96针划伤工具, 可以同时在2d 和3d 中进行伤口愈合检测。除了促进自动扫描, 提供稳定的细胞培养环境, 最大限度地中断, 使用96针划伤工具进行划痕检测提供了一致的划痕伤口, 使实验更加强大和重现。96孔板的格式提供了增加细胞系数量或不同药物治疗的额外选择。此外, 还可以记录细胞形态变化和动态运动, 以便进一步分析。
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢布隆菲尔德集团基金会通过亨特医学研究所 (hmri 13-02) 提供的资金支持。x. z 通过纽卡斯尔大学和 hcra 生物标志物旗舰博士奖学金获得 apa 奖学金。
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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