Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha
Summary
O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.
Abstract
Mobilidade de células de câncer é crucial para a iniciação de metástase. Portanto, a investigação do movimento da célula e capacidade invasiva é de grande importância. Ensaios de migração fornecem uma visão básica do movimento de célula a um nível 2D, Considerando que os ensaios de invasão são fisiologicamente mais relevantes, imitando a expulsão de célula de câncer em vivo do site original e invadindo através da matriz extracelular. O protocolo atual fornece um único fluxo de trabalho para os ensaios de migração e invasão. Juntamente com a automatizado microscópica câmera integrada para imagens HD em tempo real e análise de built-in módulo, dá pesquisadores um tempo-eficiente, simples e reprodutível opção experimental. Este protocolo inclui também substituições para os consumíveis e métodos de análise alternativos para os usuários a escolher de.
Introduction
Migração celular e invasão são importantes processos biológicos que permitem que as funções normais do corpo humano, tais como fechamento de ferida, invasão da placenta no útero e glândula mamária morfogênese1,2,3. O corpo humano tem controle preciso e rigoroso destes eventos biológicos; no entanto, existem algumas exceções. Tumores malignos, por exemplo, são capazes de escapar esta salvaguarda, apresentam proliferação anormal e invadir no tecido vizinho, que é chamado de metástase. Metástase é a principal causa de mortalidade relacionadas ao câncer4.
Câncer de mama é o mais comumente diagnosticado câncer em mulheres e é a segunda maior causa de morte por câncer entre as mulheres em países desenvolvidos no mundo5. Câncer de mama origina-se ductos ou lóbulos que consistem em uma ou mais camadas de células epiteliais. Na mama normal, as células epiteliais aderem um ao outro e a membrana basal através de proteínas de membrana, tais como E-caderina e integrinas6. No entanto, as células de câncer de mama invasivo perderam sua polaridade e adesão célula-célula e classicamente submetido a transição mesenquimal epitelial (EMT) e ganham a habilidade de mover-se. Após o extravasamento, estas células se movem a matriz extracelular (ECM) e insira o vaso sanguíneo ou o sistema linfático, seguido depois por intravasation e crescimento metastático7. Compreender os mecanismos pelos quais isso ocorre é de grande importância, desde que a metástase é a causa mais comum de mortalidades relacionadas ao câncer e está intimamente relacionado ao câncer celular migração/invasão. Para visualizar o movimento de células cancerosas, os ensaios de migração e invasão são modelos ideais para estudar o movimento de célula 2D e 3D, respectivamente. Migração avalia diretamente o movimento das células Considerando que invasão envolve a interação com o microambiente e a capacidade de degradar as barreiras biológicas. Os dois processos não são totalmente independentes um do outro, como a migração é uma exigência da invasão.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar a migração e invasão. Como comentado por Kramer et al., ensaios de migração, tais como a cicatrização de feridas, vedação e ensaios de microtransportadora geram uma área livre de célula para permitir que as células a habitar, avaliando a mudança de área; Considerando que, em ensaios transwell e capilar baseiam-se no número de células que se movem em direção a um atrator8. Para ensaios de invasão, um ambiente de ECM deve ser instituído com gel de ECM ou colágeno por exemplo, e movimento 3D pode ser avaliado, monitorando as contagens de área, distância e célula de invasão (por exemplo, transwell ensaio, ensaio de ornitorrinco)8. Um outro tipo de ensaio de invasão é combinar as células invasoras com células não-invasiva e avaliar o comportamento das células invasoras (por exemplo, ensaios de esferoide). Os métodos acima tem seus prós e contras e uma maneira fácil de abordagem, fácil de repetir e combinar o ensaio de migração e invasão de ensaio em um fluxo de trabalho semelhante é preferencial em delineamento experimental.
Este protocolo descreve a medição da migração celular e invasão usando um gerador de imagens de viver-pilha. É uma célula em tempo real, monitoramento de sistema instalado em uma incubadora de cultura de célula padrão. É preciso de imagens de alta definição, de acordo com o conjunto de varredura intervalos e medições, aplicando máscaras adequadas para as células ou alvos fluorescentes. O módulo de ensaio de migração/invasão inclui o uso de uma ferramenta para raspar 96 pinos, que é apropriada para fazer feridas zero homogêneas em uma monocamada de células em uma placa de 96 poços. O mecanismo baseia-se em vitro ferida cura ensaios, monitorar a movimentação de pilha 2D em um plástico ou superfície revestida. Invasão ou movimento 3D através de um ECM adicional dentro do zero ferido também pode ser avaliado. Um fluxo de trabalho breve é ilustrado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migração e invasão são parâmetros importantes para avaliar a mobilidade das células cancerosas. Usando a ferramenta para raspar 96-pin, é possível realizar a ferida cura ensaios em 2D e 3D simultaneamente. Além de facilitar a varredura automática, proporcionando um ambiente de cultura celular estável com o mínimo de interrupção, o zero ensaio realizado com o uso da ferramenta para raspar 96 pinos fornece consistentes feridas zero, permitindo que as experiências que são mais robustas e pode ser reproduzido…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós gostaríamos de reconhecer nosso apoio financiamento pela Fundação de grupo de Bloomfield, através do Instituto de pesquisa médica do Hunter (HMRI 13-02). X.Z é suportado por uma bolsa de APA através da Universidade de Newcastle e a bolsa de doutoramento HCRA biomarcadores emblemática.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
