سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام
Summary
ويصف البروتوكول الحالي بأسلوب متكامل يحقق سرطان الخلية الهجرة والغزو على منصة واحدة في الوقت الحقيقي، وتوفير خيار استنساخه بسهولة وكفاءة من حيث الوقت لدراسة التنقل خلية ومورفولوجيا.
Abstract
سرطان الخلية التنقل أمر حاسم للبدء بورم خبيث. ولذلك، التحقيق في حركة الخلية والقدرة الغازية ذات أهمية كبيرة. توفير فحوصات الهجرة البصيرة الأساسية لحركة الخلية على مستوى ثنائي الأبعاد، حين غزو فحوصات ذات الصلة أكثر فسيولوجيا، محاكاة المجراة في سرطان الخلية ديسلودجمينت من الموقع الأصلي والغازية عن طريق المصفوفة خارج الخلية. ينص البروتوكول الحالي على سير عمل واحد لفحوصات الهجرة والغزو. جنبا إلى جنب مع كاميرا مجهرية الآلي المتكاملة للصور عالية الدقة في الوقت الحقيقي ووحدة التحليل المدمج، أنه يعطي الباحثين الوقت-الكفاءة، خيار بسيط واستنساخه تجريبي. ويشمل هذا البروتوكول أيضا بدائل للمواد الاستهلاكية وأساليب تحليل بديلة للمستخدمين للاختيار من بينها.
Introduction
الهجرة الخلية وغزو من العمليات البيولوجية الهامة التي تمكن الوظائف الطبيعية في الجسم البشري، مثل إغلاق الجرح، غزو المشيمة في الرحم والغدة الثديية morphogenesis1،،من23. الجسم البشري لديه مراقبة دقيقة وصارمة لهذه الأحداث البيولوجية؛ ومع ذلك، هناك بعض الاستثناءات. على سبيل المثال، الأورام الخبيثة، قادرون على الهروب من هذه الضمانات، ويحمل انتشار غير طبيعي وتغزو الأنسجة المجاورة، وهو ما يسمى ورم خبيث. ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفيات المتصلة بالسرطان4.
سرطان الثدي هو الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان في النساء، وهو ثاني أكبر سبب للوفيات المتصلة بالسرطان بين النساء في البلدان المتقدمة في العالم5. ينشأ سرطان الثدي من القنوات أو الفصيصات التي تتكون من واحد أو أكثر من طبقات من الخلايا الظهارية. في الثدي الطبيعي، تنضم الخلايا الظهارية لبعضها البعض والغشاء الطابق السفلي عن طريق بروتينات الغشاء مثل ه-كادهيرين وإينتيجرينس6. ولكن خلايا سرطان الثدي الغازية فقدوا قطبية والالتصاق خلية خلية، وتقليدياً الخضوع الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT) واكتساب القدرة على التحرك. بعد التسرب، هذه الخلايا تتحرك عبر المصفوفة خارج الخلية (ECM) وإدخال الأوعية الدموية أو اللمفاوي، تليها ثم إينترافاسيشن والنمو المنتشر7. فهم الآليات التي يحدث هذا يتسم بأهمية كبيرة، نظراً لورم خبيث هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المتصلة بالسرطان، ويرتبط ارتباطاً وثيقا بسرطان الخلية الهجرة/الغزو. تصور حركة الخلايا السرطانية، فحوصات الهجرة والغزو، نماذج مثالية لدراسة حركة الخلية في 2D و 3D، على التوالي. ويقيم الهجرة مباشرة حركة الخلايا حين غزو ينطوي على تفاعل مع المكروية والقدرة على تخفيض الحواجز البيولوجية. هاتين العمليتين ليست مستقلة تماما عن بعضها البعض، كما الهجرة شرط للغزو.
وقد وضعت عدة طرق لدراسة الهجرة والغزو. كما استعرض بها كرامر et al، فحوصات الهجرة قبيل التئام الجروح، السور وفحوصات الصغرى-الناقل إنشاء منطقة خالية من الخلية السماح بالانتقال إلى الخلايا تقييم تغيير المنطقة؛ في حين، فحوصات ترانسويل والشعرية تستند إلى العدد الخلايا التي تتحرك نحو جاذبة8. لفحوصات الغزو، بيئة إدارة المحتوى في المؤسسة إعداد باستخدام الكولاجين أو هلام إدارة المحتوى في المؤسسة وعلى سبيل المثال، ويمكن تقييم الحركة ثلاثية الأبعاد من خلال رصد التهم غزو المنطقة والمسافة وخلية (مثل التحليل ترانسويل، الإنزيم خلد الماء)8. نوع آخر من الفحص الغزو هو الجمع بين الخلايا الغازية مع الخلايا غير الغازية وتقييم سلوك الخلايا الغازية (مثل فحوصات كروي). الأساليب المذكورة أعلاه الإيجابيات والسلبيات، وطريقة سهلة للنهج، سهل لتكرار، والجمع بين التحليل الهجرة والمقايسة الغزو في سير عمل مماثلة تفضيلية في التصميم التجريبي.
ويصف هذا البروتوكول قياس الهجرة الخلية والغزو تصوير الخلية تعيش باستخدام. خلية في الوقت الحقيقي رصد النظام المثبتة في حاضنة ثقافة خلية قياسية. فإنه يأخذ صور عالية الوضوح ووفقا لمجموعة مسح الفواصل الزمنية والقياسات عن طريق تطبيق أقنعة مناسبة للخلايا أو أهداف الفلورسنت. الوحدة النمطية للهجرة/غزو المقايسة تتضمن استخدام أداة 96-دبوس الصفر، ومناسبة لصنع الجروح الصفر متجانسة على أحادي الطبقة خلية في صفيحة 96-جيدا. وتستند الآلية الجرح في المختبر شفاء فحوصات، ورصد حركة الخلية 2D على البلاستيك أو سطح مصقول. ويمكن أيضا تقييم الغزو أو الحركة ثلاثية الأبعاد عبر المحتوى إضافية داخل الصفر الجرح. سير عمل موجزة يتضح في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهجرة والغزو من المعالم الهامة لتقييم انتقال الخلايا السرطانية. باستخدام أداة 96-دبوس الصفر، من الممكن إجراء الجرح الشفاء فحوصات في 2D و 3D في وقت واحد. وبصرف النظر عن تيسير المسح التلقائي، توفير بيئة ثقافة خلية مستقرة مع الحد الأدنى من التعطيل، يوفر المقايسة الصفر التي أجريت باستخدام أداة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف بدعمنا التمويل من “مؤسسة مجموعة بلومفيلد” عن طريق معهد البحوث الطبية هنتر (همري 13-02). X.Z تدعمه منحة أبا عن طريق جامعة نيوكاسل و “منحة الدكتوراه الرائد المؤشرات الحيوية هكرا”.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
