自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー
Summary
現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。
Abstract
がん細胞移動は転移の開始にとって重要です。したがって、細胞運動と侵襲的な容量の調査は意義があります。移行の試金は浸潤アッセイは、生体内でがん細胞外れて元のサイトの真似をして細胞外マトリックスを介して侵入、もっと生理学的関連に対し 2 D レベルで細胞運動の基本的な洞察力を提供します。現在のプロトコルは、移行および侵略の試金のための単一のワークフローを提供します。一緒に統合された自動顕微鏡カメラ リアルタイム HD 画像と内蔵の解析モジュールのため、それは研究者、時間の効率的なシンプルで再現性のある実験的なオプションを提供します。このプロトコルには、消耗品の置換とから選択するユーザーのための代替手法も含まれています。
Introduction
細胞の遊走と浸潤は、創傷閉鎖、胎盤の子宮と乳腺形態1,2,3への侵入など、人間の体の正常な機能を可能にする重要な生物学的プロセスです。人間の体はこれらの生物学的イベントの正確かつ厳格に管理ただし、いくつかの例外があります。悪性腫瘍、たとえば、このセーフガードを脱出し、異常増殖を示す転移と呼ばれる、周辺の組織に侵入することが。転移は癌関連死亡率4の主要な原因です。
乳がんは、最も一般的女性の癌を診断され、先進国世界5の女性の間で癌関連死の 2 番目に高い原因です。乳がんは、ダクトや小葉の上皮細胞の 1 つまたは複数のレイヤーで構成されるから起きる。通常の乳房の上皮細胞は互いと E-カドヘリンやインテグリン6などの膜蛋白質を介して基底膜に付着します。しかし、浸潤性乳癌細胞の極性や細胞接着を失っている古典的な上皮間葉転換 (EMT) を受けるし、移動する能力を得る。血管外漏出後、これらの細胞は細胞外マトリックス (ECM) の間で移動し、血管やリンパ系、それから続いて intravasation と転移の成長7を入力します。これが発生するメカニズムを理解することが重要、以来、転移癌関連死亡の最も一般的な原因し、密接に関連してがん細胞の移行/侵略。がん細胞の動きを可視化、移行と浸潤アッセイ、2 D と 3 D の細胞運動をそれぞれ研究に理想的なモデルです。移行は直接侵入、微小環境と生物学的障壁を低下させる能力との相互作用を含むに対し、細胞の運動を評価します。移行は侵略の要件として 2 つのプロセスは、互いに完全に独立しています。
移行と侵略を研究するいくつかの方法が開発されています。フェンスとマイクロ キャリア ・ アッセイが領域の変化を評価するセルを移動できるように携帯無料領域を生成として Kramer ら、創傷治癒など移行アッセイによって一方、transwell と毛細血管のアッセイは、誘引8に向かって移動するセルの数に基づいています。ECM 環境は例えば、ECM ゲルやコラーゲンを設定する、浸潤アッセイと侵攻エリア、距離、セル数 (例えば transwell 試金、カモノハシの試金) を監視することによって 3次元の動きを評価する8。浸潤能の測定の別のタイプは、非侵襲的な細胞の侵襲性のセルを結合し、侵襲的な細胞の行動を評価する (例: 回転楕円体試金)。上記の方法の長所と短所と簡単にアプローチを繰り返して、移行アッセイを結合する簡単な方法があるし、似たようなワークフローの浸潤能の測定は実験的なデザインで優遇。
このプロトコルでは、細胞の遊走と浸潤細胞の撮像素子を使用しての測定について説明します。標準細胞文化のインキュベーターでインストールされているシステムを監視リアルタイム細胞です。スキャン間隔と測定セルまたは蛍光体に適切なマスクを適用することによって設定によると高精細画像がかかります。96 ウェル プレートに細胞膜上に均一なひっかき傷を作りに適した 96 ピンのスクラッチ ツールを使用して移行・浸潤アッセイのモジュールが含まれます。機構は、体外傷癒しの試金、プラスチックや塗装面に 2次元細胞運動の監視に基づいています。侵略やスクラッチ傷内追加 ECM 間で 3次元の動きも評価することができます。簡単なワークフローを図 1に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
移行と侵略は、癌細胞の移動を評価する重要なパラメーターです。96 ピンのスクラッチ ツールを使用して、2 D と 3 D の試金を同時に治癒を行うことが可能です。別に自動スキャンを促進する、最小限の中断で安定的な培養環境を提供する 96 ピンのスクラッチ ツールを用いてスクラッチ試験提供一貫したスクラッチ傷より堅牢な実験を有効にして再現できます。96-well 版のフォーマットは、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ハンター医療研究所 (HMRI 13-02) を通じてブルーム フィールド グループ財団の資金援助を承認したいと思います。X.Z をサポートするには、ニューカッスル大学を通じて APA 奨学金と HCRA バイオ マーカー旗艦博士課程奨学金。
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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