В пресмыкающихся липиды кожи с сородичами имеют решающее значение для сексуальной сигнализации, с потенциального использования в управлении инвазивных видов. Здесь мы описываем протоколы для извлечения липиды кожи от кожи сарай или всей животных, определение и анализ всего липидной массы и отделяя липиды, используя фракционирование через колоночной хроматографии.
Рептилий сигнал сородичами, используя липидов в их коже, главным образом, с тем чтобы мате отслеживания и оценки. Изоляции эти липиды имеет программа исследований, посвященных эволюции моделей и механизмов химической связи, в дополнение к пониманию гидроизоляции роли липидов в эволюции земной жизни. В прикладной подход такие сигналы, основанные на кожу у потенциального использования для дикой природы менеджеров, занимающихся инвазивных видов. Основные шаги для количественной оценки липиды кожи рептилий в протоколе, представленные здесь включают извлечение, решимость всего липидов и фракционирование через колоночной хроматографии, последний процесс, в результате чего очищенная элюаты соединений, которые можно затем либо быть проанализированы, чтобы назначить составные идентификаторы (например, газовая хроматография масс-спектрометрии [GC-MS]) или используется непосредственно в более изысканной bioassays. Липиды кожи могут быть извлечены из жизни кожи, пролил кожи, или мертвый весь животных, с использованием неполярных органических растворителях (например, гексан, бензола, толуола). Добыча solubilizes липиды и, затем, можно испаряется растворитель поддаваться измерению липидов только экстракт. Фракционирование предполагает разделение всего липидов экстракт в конкретных элюаты через традиционные колоночной хроматографии. Экстракт всего липидов сначала привязан к субстрат на основе столбца (например, алюминия) и, затем, отдельные элюаты («дроби») растворителя на определенных томов передаются последовательно через колонку для элюировать наборы соединений из смеси липидов на основе общих полярности. Прогресс фракций в полярности в стандартной последовательности путем увеличения относительного количества полярных растворителей (например, диэтиловый эфир) в неполярных растворителей. В этой рукописи мы описывают несколько методов для извлечения липиды кожи рептилий и, затем, предоставляют стандартный протокол для изоляции различных наборов соединений, основанный на полярности, с использованием традиционных колоночной хроматографии. Извлекает весь липидов или определенных фракций затем использоваться в bioassays для определения любой биологической активности, вызвал соединениями в нем.
Рептилий производят липидов эпидермиса, непосредственно из клеток кожи или из дискретных желез, которые используются в социальной коммуникации, таких как мат оценки и отслеживания, территориальности, интра – и межвидовых признание1,2 ,3,4. Изоляции эти липиды кожи имеет программа исследований, посвященных эволюции моделей и механизмов химической связи, в дополнение к пониманию роли гидроизоляции липидов в эволюции земной жизни2,3 ,4. Кроме того, много пресмыкающихся, особенно окостенение (ящерицы, змеи), инвазивных видов, вызывающих озабоченность в чувствительных экосистем, и разработка на основе феромонов приманки для улучшения улавливания и удаления текущих5,6. Герметичность кожи рептилий облегчает извлечение липидов, для получения относительно чистой добычи потенциально надежным источником химических сигналов. Принцип действия для количественной оценки липиды кожи рептилий в протоколе описаны включают добычу, решимость всего липидов и фракционирование через столбец хроматографии1,6,7. Методы были использованы регулярно как они дают биоактивные изолятов, которые объяснить многое о Мате выбор и выбор, особенно в змей2.
Липиды кожи могут быть извлечены из жизни кожи, кожи сарай, или мертвый весь рептилий, используя неполярных или полярных органических растворителях1,,78,9. Следует отметить, что музейных образцов хранятся в растворителях, таких как этанол не являются оптимальными для извлечения липиды кожи, и только свежие или свежий замороженные туши должны рассматриваться в качестве возможных источников для извлечения. Липиды кожи являются инертными, который делает их устойчивыми на поверхности кожи и легко извлечь7. В их сигнальный ролей в экологии рептилий коже липидов сигналы часто залегают в суровых условиях, но из-за их надежный химические свойства, такие сигналы могут сохранять их информативность длительное время10,11 , 12. процесс извлечения solubilizes липиды, используя неполярных растворителей (например, гексан, бензола, толуола) над многочасовым замочить, следуют испарения растворителя, чтобы оставить измерению массы липидов экстракт7 , 8. липиды кожи являются весьма смешивается в неполярных растворителей, и широкий спектр углеводороды могут быть извлечены из аналогично разнообразных источников.
Фракционирование является более трудоемким, чем добыча, но служит для разделения всего липидов экстракт в определенных фракций через колоночной хроматографии, чтобы помочь очистки и возможности идентификации соединений нем1, 6 , 7 , 8. всего липидов экстракт привязан к столбцу, на основе субстрата, а затем отдельные элюаты («дроби») растворителя на определенных томов передаются последовательно через колонку для элюировать наборы соединений из смеси липидов, которые имеют общие полярности6,,78. В хроматографии липидов, фракций прогресс в полярности на некоторых стандартизированная последовательность путем увеличения относительного количества полярных растворителей (например, диэтиловый эфир) в неполярных растворителей (обычно выражается в процентах: 0%, 2%, 4% эфира, и т.д. )6,,78. Хотя методы как тонкослойной хроматографии (ТСХ) могут быть использованы для разделения липидов в смеси и проще, колоночной хроматографии предпочитают потому что он использует закрытые системы, является легко контролировать, можно отдельно больше сосредоточены смеси и совместим с мультиплексирование для повышения эффективности. В этой рукописи мы описывают несколько методов для извлечения липиды кожи рептилий и, затем, предоставляют стандартный протокол для изоляции различных наборов соединений, основанный на полярности, с использованием традиционных колоночной хроматографии. Во многих исследовательских проектах с участием изоляции химические сигналы конечной целью является для осуществления изменений в приемники, подвержены эти сигналы. Извлекает весь липидов или определенных фракций затем использоваться в bioassays для определения любой биологической активностью вызвал соединениями нем1,2,6,7. В основных биологических исследований например, bioassays, с использованием конкретных фракций можно выявить исследователей что очищенный источник феромоны был изолирован, и затем, могут осуществляться методы для определения целевых соединений. С точки зрения управления дикой природы идентификации не может быть целью, и вместо этого, активная фракция могут использоваться в области привлечения сородичами ловушки или подавляют Мате, отслеживание в неродном Хабитат13,14.
Экстракции липидов кожи рептилий может применяться для живых или мертвых кожу, помимо пролил кожи, который обеспечивает универсальность в экспериментальное применение этой техники. Кроме того экстракции липидов кожи может быть сделано в поле, чтобы включить динамическое применение метода к широкому спектру биологи2,13. Извлечение липидов кожи очень проста; Таким образом это легко масштабировать извлечения при необходимости за эксперимент или дизайн, и практиков не нужно иметь значительный опыт для выполнения методов. Только ограничивающих факторов для расширения масштабов являются наличие дыма капот пространства, обилие чистой, герметичные посуды и растворителей дискового пространства.
Коже липидов экстракт фракционирования могут быть приспособлены к потребностям исследователь и, таким образом, имеет аналогичную гибкость для экстракции липидов. Например можно этого eluted и затем отбрасывается, чтобы привести целевых фракций, которые могут очищать соединений интерес или упростить bioassays нейтральные липиды. Фракционирование может выполняться на нескольких уровнях в рамках образцы липидов и. Например несколько столбцов можно запустить одновременно, чтобы сделать этот процесс более эффективным. Или только часть всего липидов экстракт можно фракционированный на небольшую колонку жалеть, таким образом, реактивы и время. Фракционирование ограничивается главным образом масса всего липидов экстракта и точность оборудования для исследователя. Например если исследователь имеет баланс с точностью 10,0 мг, определение доли массы и, следовательно, точность пробоподготовки для анализа ГХ-МС значительно, если не полностью, затруднена. То же самое верно для посуды. Если исследователь имеет столбец большого объема для фракционирования, но имеет небольшой всего липидной массы отделить, элюирование или разделение соединений будет прогрессировать, но потребует значительных потерь растворителей, реактивов, время, и потенциально, целевой соединения сами.
Рекомендуется выполнить проверку контроля качества перед определением элюции схеме, как показано в таблице 2, и решить, какие фракции могут игнорироваться. Для подтверждения элюции желаемого липиды, столбец может быть запуск где собираются отдельно и затем анализируется каждой фракции, 1-15, с использованием GC-MS. На рисунке 3представитель газовый хроматограф следы показывают, что метил кетонов от подвязки змей только элюировать из столбца в конкретной фракции. Выполняя этот шаг контроля качества, изменение элюции схемы могут быть разработаны для данного вида обеспечить максимальный выход соединений интерес. Изменения в материалах, таких как поставщик или много глинозема или возраст диэтиловом эфире, будет абсолютно привести к различиям в элюции, которые должны контролироваться для выполнения контроля качества тестирования.
Методы, описанные ограничены главным образом по химической природе сигналы, которые могут быть получены. Прежде всего эти методы позволяют только исследователям изолировать и отдельные длинноцепочечных липиды из кожи рептилий. Много видов пресмыкающихся использование бортовых и/или белковых сигналы как химические сигналы, и описанные методы несовместимы с изоляции сказал подсказки. Кроме того, неполярных растворителей не будет извлекать водный сигналы от поверхности рептилий или источников кий осаждения (например, Кейдж воды, фекалии, водной субстрата), который может действительно содержать многочисленные химические сигналы. Соответствующие методы для захвата этих видов подсказок доступны исследователям (например, твердофазный микроэкстракция [SPME] для летучих подсказки и жидкостной хроматографии [ВЭЖХ] высокой производительности для водной подсказки), хотя, как методы описано выше, существует технический кривой обучения.
Самое главное утилита окончательный химическая смесь для исследователя должны руководствоваться используемых методов. Например если исследователь хочет знать, если мужчины фокуса животного может различать сигналы, производимые мужчины против женщин горбачей в целенаправленной помощи биопроб, добыча является единственным методом необходимо2,3. Если целью является выявление сексуально диморфных соединений, однако, экстракт должны быть очищены, чтобы включить большее доверие назначение идентификации конкретных молекул или групп молекул через химический анализ1, 6,9,11. Однако даже проводить хроматографии с источником липидов, значительной массы начиная экстракт является обязательным, так что измеримые долю массы может быть получен; в противном случае объединение образцов может осуществляться, но не является оптимальным14.
Будущее этого протокола включают меры использовать и адаптировать процедуры более рептилий видов. Разрабатываются также дополнительные неинвазивные методы извлечения липиды кожи.
The authors have nothing to disclose.
Разработка этих методов, особенно сарай кожи экстракции липидов, произошло во время совместных соглашений (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA и 16-7412-1269-CA) между Джеймс Madison университет (JMU) и министерства сельского хозяйства США животных и растений инспекционной службы здравоохранения (APHIS). М.Р.П признает вклад следующих студентов к разработке методов кожи пролить: S. Пател (Университет Вашингтона и ли [ГССПСО]), J. Zachry (ГССПСО), р. Флорес (JMU), J. Noll (JMU) и S. Эштон (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |