In reptielen zijn huid lipiden van soortgenoten cruciaal voor seksuele signalering, met potentiële gebruik in beheer van invasieve soorten. Hier beschrijven we protocollen voor het extraheren van huid lipiden uit schuur huid of hele dieren, bepalen en analyseren van de totale lipide-massa en de lipiden met behulp van fractionering via kolom-chromatografie te scheiden.
Reptielen signaal naar soortgenoten gebruik van lipiden in hun huid, vooral voor het inschakelen van stuurman bijhouden en beoordeling. De isolatie van deze lipiden heeft nut in onderzoek gericht op evolutionaire patronen en mechanismen van chemische communicatie, naast het begrip van de dakbedekking rol van lipiden in de evolutie van het aardse leven. In een toegepaste aanpak hebben dergelijke signalen huid gebaseerde potentiële gebruik voor wildlife managers omgaan met invasieve soorten. De belangrijkste stappen voor het kwantificeren van de reptile huid lipiden in het protocol hier gepresenteerd omvatten extractie, bepaling van de totale lipide en fractionering via kolom-chromatografie, het laatste proces resulteert in gezuiverde eluaten van verbindingen die dan kunnen ofwel worden geanalyseerd om het toewijzen van samengestelde identificaties (bijvoorbeeldgaschromatografie-massaspectrometrie [GC-MS]) en/of rechtstreeks in de meer verfijnde bioassays gebruikt. Huid lipiden kunnen worden geëxtraheerd uit levende huid, huid, of dood hele dieren, waarbij apolaire organische oplosmiddelen worden gebruikt (bijvoorbeeldhexaan, benzeen, tolueen) werpen. Extractie lost de lipiden en, vervolgens, het oplosmiddel verdampt kan worden zodanig dat deze een meetbare alleen-lipide-extract. Fractionering betreft de scheiding van het extract van de totale lipide in specifieke eluaten via traditionele kolom-chromatografie. Het totale lipide-extract is eerst gebonden aan een substraat-gebaseerde kolom (bijvoorbeeld, aluminiumoxide) en, vervolgens, individuele eluaten (“fracties”) van oplosmiddel bij specifieke volumes sequentieel worden doorgegeven via de kolom Elueer sets van stoffen uit het lipide-mengsel op basis van gemeenschappelijke polariteit. De voortgang van de breuken in polariteit op een gestandaardiseerde reeks doordat de relatieve hoeveelheid polair oplosmiddel (b.v., diethylether) in apolaire oplosmiddelen. In dit manuscript, we beschrijven van verschillende methoden voor het extraheren van de huid van reptielen lipiden en, geef een standaardprotocol voor het isoleren van verschillende sets van verbindingen op basis van polariteit, met behulp van traditionele kolom-chromatografie. Hele lipide extracten of specifieke breuken kunnen vervolgens worden gebruikt in bioassays elke biologische activiteit ontlokte daarin door de verbindingen te bepalen.
Reptielen produceren lipiden in de epidermis, hetzij rechtstreeks van huidcellen discrete klieren die worden gebruikt in de sociale communicatie, zoals de beoordeling van de mate en bijhouden, territorialiteitsbeginsel, intra- en interspecifieke erkenning1,2 ,3,4. De isolatie van deze huid lipiden heeft nut in onderzoek gericht op evolutionaire patronen en mechanismen van chemische communicatie, naast het begrip van de dakbedekking rol van lipiden in de evolutie van de aardse leven2,3 ,4. Verder, veel reptielen, vooral squamates (hagedissen, slangen), zijn invasieve soorten van zorg in gevoelige ecosystemen, en de ontwikkeling van feromoon gebaseerde kunstaas overlapping en verwijdering te verbeteren is lopende5,6. De ondoordringbaarheid van reptile huid vergemakkelijkt de extractie van de lipiden aanwezig om relatief pure extracties uit te voeren van een potentieel krachtige bron van chemische signalen. Het beginsel stappen voor het kwantificeren van reptile huid lipiden in het protocol beschreven omvatten extractie, bepaling van de totale lipide en fractionering via kolom-chromatografie1,6,7. De methoden zijn routinematig gebruikt zoals zij opleveren bioactieve isolaten die veel over partner keuze en selectie, met name in slangen2 verklaren.
Huid lipiden kunnen worden geëxtraheerd uit levende huid, schuur de huid, of dood hele reptielen, met behulp van apolaire of polaire organische oplosmiddelen1,,7,,8,9. Opgemerkt moet worden dat museum specimens opgeslagen in oplosmiddelen zoals ethanol, niet optimaal voor de winning van huid lipiden zijn en alleen vers of vers bevroren karkassen moeten worden beschouwd als mogelijke bronnen voor extractie. Huid lipiden zijn inert, waardoor ze stabiel op de oppervlakte van de huid en makkelijk te uittreksel van7. In hun signalering rollen in reptiel ecologie, huid lipide signalen zijn vaak gedeponeerd in ruwe omgevingen, maar vanwege hun robuuste chemische eigenschappen, dergelijke signalen kunnen behouden hun waarde informatie gedurende lange perioden van tijd10,11 , 12. het extractieproces lost de lipiden, met behulp van een apolaire oplosmiddelen (bijvoorbeeldhexaan, benzeen, tolueen) over een uur-lange weken, gevolgd door de verdamping van het oplosmiddel, te vertrekken van een meetbare hoeveelheid lipide uittreksel7 , 8. huid lipiden zijn zeer mengbaar in apolaire oplosmiddelen, en een breed scala van koolwaterstoffen kan worden geëxtraheerd uit een evenzo divers scala van bronnen.
Fractionering meer moeizaam dan extractie is maar dient om te scheiden van het extract van de totale lipide in specifieke breuken via kolom-chromatografie, om te helpen bij de zuivering en mogelijke identificatie van de stoffen daarin1, 6 , 7 , 8. het totale lipide-extract is gebonden aan een substraat-gebaseerde kolom, en vervolgens afzonderlijke eluaten (“fracties”) van oplosmiddel bij specifieke volumes sequentieel worden doorgegeven via de kolom Elueer sets van verbindingen van het lipide-mengsel die een gemeenschappelijke polariteit6,7,8. In lipide chromatografie, de voortgang van de breuken in de polariteit bij enkele reeks gestandaardiseerd door verhoging van de relatieve hoeveelheid polair oplosmiddel (b.v., diethylether) in apolaire oplosmiddelen (meestal uitgedrukt als een percentage: 0%, 2%, 4% ether, enz. )6,7,8. Hoewel methoden als dunne-laag chromatografie (TLC) kan worden gebruikt om te scheiden van lipiden in een mengsel en zijn eenvoudiger, kolom-chromatografie voorkeur omdat het gebruik maakt van een gesloten systeem, makkelijk is te besturen, kunt afzonderlijke meer geconcentreerd mengsels, en is compatibel met multiplex voor efficiëntie. In dit manuscript, we beschrijven van verschillende methoden voor het extraheren van de huid van reptielen lipiden en, geef een standaardprotocol voor het isoleren van verschillende sets van verbindingen op basis van polariteit, met behulp van traditionele kolom-chromatografie. In vele onderzoeksprojecten waarbij het isolement van chemische signalen, is het uiteindelijke doel om veranderingen te bewerkstelligen in de ontvangers blootgesteld aan deze signalen. Hele lipide extracten of specifieke breuken kunnen, vervolgens in bioassays worden gebruikt om te bepalen dat welke biologische activiteit ontlokte door de verbindingen daarin1,2,6,7. In fundamenteel biologisch onderzoek, bijvoorbeeld kunnen bioassays met behulp van specifieke breuken en openbaren aan onderzoekers dat een zuivere bron van feromonen is geïsoleerd, vervolgens methoden voor de identificatie van de doel-verbindingen kunnen worden nagestreefd. Vanuit een wildlife management perspectief, kan identificatie niet het doel, en in plaats daarvan, de actieve breuk kan worden gebruikt in het veld om trekken soortgenoten te vallen of remmen stuurman bijhouden in de native habitat13,14.
De winning van huid lipiden in reptielen kan worden toegepast op levende of dode huid, naast de schuur huid, die veelzijdigheid in de experimentele toepassing van deze techniek biedt. Verder, extracties van huid lipiden kunnen gebeuren in het veld om een dynamische toepassing van de methode op een breed scala aan biologen2,13. Extractie van huid lipiden is eenvoudig; Daarom, het is gemakkelijk omhoog aan schaal extracties zo nodig per experiment of ontwerp en beoefenaars hoeft niet aanzienlijke deskundigheid uit te voeren van de methoden. De enige beperkende factoren voor schaalvergroting zijn de beschikbaarheid van fume hood ruimte, een overvloed aan schone, hersluitbaar glaswerk en oplosmiddel opslagruimte.
Huid lipide extract fractionering kan worden afgestemd op de behoeften van een onderzoeker en heeft dus dezelfde flexibiliteit met lipide aardgaswinning. Neutrale lipiden kunnen bijvoorbeeld worden geëlueerd en vervolgens verwijderd, om te resulteren in doel breuken die kunnen verbindingen van belang te zuiveren of te vereenvoudigen van bioassays. Fractionering kan worden uitgevoerd op meerdere schalen binnen en tussen lipide monsters. Bijvoorbeeld, kunnen meerdere kolommen tegelijk worden uitgevoerd om het proces efficiënter te maken. Of slechts een gedeelte van een totale lipide-extract kan worden fractionated op een kleine kolom aan, dus sparen reagentia en tijd. Fractionering wordt vooral beperkt door de massa van het totale lipide-extract en de precisie van de apparatuur beschikbaar aan de onderzoeker. Bijvoorbeeld, als de onderzoeker een balans met een nauwkeurigheid van 10.0 mg, de bepaling van de breuk massa en dus ook heeft wordt de nauwkeurigheid van de bereiding van de monsters voor de GC-MS-analyse aanzienlijk, zo niet volledig, belemmerd. Hetzelfde geldt voor het glaswerk. Als de onderzoeker heeft een groot volume kolom voor fractionering, maar heeft een kleine totale lipide massa te scheiden, de elutie of de scheiding van de stoffen zal vooruitgang maar vergt een aanzienlijke verspilling van oplosmiddelen, reagentia, tijd en potentieel, het doel verbindingen zelf.
Het is aangeraden om het uitvoeren van een controle van de kwaliteitscontrole voor het bepalen van de elutie regeling, zoals te zien in tabel 2, en beslissen welke fracties mag worden weggegooid. Te bevestigen de elutie van de gewenste lipiden, een kolom kan worden run waar elke fractie, 1-15, individueel verzameld en vervolgens geanalyseerd via GC-MS. In Figuur 3tonen representatieve gaschromatograaf sporen dat methyl ketonen van Kousenband slangen alleen Elueer uit de kolom in een bepaalde fractie. Door het uitvoeren van deze stap kwaliteitscontrole, kan een gemodificeerde elutie-regeling worden ontwikkeld voor een bepaalde soort om de maximale opbrengst van de verbindingen van belang. Wijzigingen in de materialen, zoals de leverancier of de partij van de aluminiumoxide of de leeftijd van de diethylether, zullen absoluut leiden tot verschillen in elutie die moeten worden gecontroleerd voor door het uitvoeren van een test van de kwaliteitscontrole.
De beschreven technieken zijn beperkt door de chemische aard van de signalen die kunnen worden verkregen. Vooral toestaan deze methoden alleen onderzoekers te isoleren en lange-keten lipiden te scheiden van de huid van reptielen. Veel soorten reptielen lucht en/of eiwithoudende signalen gebruiken als chemische signalen, en de beschreven methoden zijn niet compatibel met het isoleren van de genoemde signalen. Verdere, apolaire oplosmiddelen zal niet uitgepakt waterige signalen uit de oppervlakken van reptielen of bronnen van cue afzetting (bijvoorbeeldkooi water, fecale materie, aquatische substraat) die inderdaad overvloedige chemische signalen kunnen bevatten. Passende methoden voor het vastleggen van dit soort signalen zijn beschikbaar voor onderzoekers (bvsolid-phase microextraction [SPME] voor vluchtige signalen en krachtige vloeibare chromatografie [HPLC] voor waterige signalen), hoewel, zoals de methoden hierboven beschreven, is er een technische leercurve.
Belangrijker, moet het nut van het definitieve chemische mengsel aan de onderzoeker begeleiden de gebruikte methoden. Bijvoorbeeld, als een onderzoeker wil weten als een mannelijke focal dier onderscheid tussen de signalen geproduceerd door mannelijke vs. vrouwelijke soortgenoten in een gerichte bioassay maken kan, is extractie dat de enige methode nodig2,3. Als de identificatie van seksueel dimorphic verbindingen het doel is, echter moet het extract gezuiverd worden, zodat een groter vertrouwen in de identificaties toe te wijzen aan specifieke moleculen en groepen moleculen via chemische analyse1, 6,9,11. Om uit te voeren zelfs chromatografie met een lipide-bron, is een belangrijke massa van het starten van extract echter vereist zodat meetbare opgebrachte hoeveelheid kunnen worden verkregen; anders, de bundeling van monsters kan worden nagestreefd maar niet optimale14.
Toekomstige ontwikkelingen van dit protocol omvat maatregelen om te gebruiken en aanpassen van de procedure voor meer reptiel soorten. Extra noninvasive methoden voor de winning van huid lipiden zijn ook ontwikkeld.
The authors have nothing to disclose.
De ontwikkeling van deze methoden, met name schuur huid lipide extractie, voorgedaan samenwerkingsovereenkomsten (14-7412-1061-CA 15-7412-1155-CA en 16-7412-1269-CA) tussen James Madison Universiteit (JMU) en het Amerikaanse ministerie van landbouw dier en Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. erkent de bijdragen voor de volgende studenten aan de ontwikkeling van de schuur huid methoden: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) en S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |