ב זוחלים, ליפידים העור של בני מינו הינן קריטיות לצורך איתות מינית, עם פוטנציאל השימוש בניהול מין פולש. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור חילוץ העור ליפידים מן המחסן עור או כל בעלי החיים, קביעת ניתוח המסה סה כ שומנים בדם ואת המפריד בין ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה fractionation באמצעות העמודה.
זוחלים של אות בני מינו באמצעות שומנים בעור שלהם, בעיקר כדי לאפשר חבר מעקב והערכה. בידודו של שומנים אלה יש כלי המחקר התמקד אבולוציונית דפוסים ומנגנונים של תקשורת כימית, בנוסף להבין את התפקיד איטום של ליפידים באבולוציה של החיים הארציים. בגישה יישומית, רמזים כזה המבוסס על העור יש שימוש פוטנציאלי למנהלים חיות בר התמודדות עם מינים פולשניים. השלבים העיקריים לכימות זוחלים שומנים בעור בפרוטוקול המובאת כאן כוללים חילוץ, נחישות השומנים הכולל fractionation באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, התהליך האחרון וכתוצאה מכך מטוהרים eluates של תרכובות אשר יכול אז גם להיות מנותח להקצאת מתחם ההזדהויות (למשל, גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית [GC-MS]) ו/או משתמשים בו ישירות בתוך bioassays מעודנת יותר. שומנים בעור יכול להיות מופק העור המגורים, לשפוך את העור, או מת כל בעלי חיים, שימוש בממסים אורגניים פולרי (למשל, הקסאן, בנזן, טולואן). חילוץ solubilizes ליפידים ו, אז, הממס יכול להיות התאדו להניב תמצית ליפידים בלבד מדיד. Fractionation כרוך ההפרדה של תמצית השומנים הכולל לתוך eluates ספציפי באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. תמצית ליפידים הכולל קודם מאוגד לעמודה מבוססת על המצע (למשל, אלומינה), לאחר מכן, בודדים eluates (“שברים”) של הממס בעוצמות ספציפיים מועברים ברצף באמצעות העמודה כדי elute קבוצות של תרכובות מעירוב השומנים מבוסס על קוטביות נפוצות. ההתקדמות שברים קוטביות על רצף סטנדרטית על ידי הגדלת הכמות היחסית של הממס קוטביים (למשל, דיאתיל אתר) ממס פולרי. כתב יד זה, אנחנו מתארים מספר שיטות לחילוץ שומנים בעור של זוחלים ומספקים, ואז, פרוטוקול תקני לבידוד סטים שונים של תרכובות בהתבסס על קוטביות, באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. כל השומנים תמציות או שברים ספציפיים, לאחר מכן, ניתן להשתמש ב- bioassays כדי לקבוע כל פעילות ביולוגית שהפיק את תרכובות ובזה.
זוחלים לייצר ליפידים האפידרמיס, ישירות מתוך תאי העור או מכל בלוטות בדידים הנמצאים בשימוש בתקשורת חברתית, כגון הערכת חבר, מעקב, הטריטוריאליות, ואינטרה – זיהוי interspecific1,2 3, ,4. בידודו של שומנים אלה העור יש כלי המחקר התמקד אבולוציונית דפוסים ומנגנונים של תקשורת כימית, בנוסף להבין את התפקיד איטום של ליפידים באבולוציה של החיים הארציים2,3 ,4. יתר על כן, זוחלים רבים, במיוחד squamates (לטאות, נחשים), הן מין פולש של דאגה, מערכות אקולוגיות רגיש, התפתחות מבוסס-פרומון פתיונות לשיפור והסרה של השמנה הוא שוטף5,6. אטימות של עורות של זוחלים מקלה על החילוץ של ליפידים הנוכחי כדי להשיג עקירות יחסית טהורה של מקור שעשויות להיות חזקים של אותות כימיים. השלבים עיקרון לכימות זוחלים שומנים בעור בפרוטוקול שתואר כוללים חילוץ, השומנים הכולל קביעת fractionation באמצעות העמודה כרומטוגרפיה1,6,7. השיטות שימשו באופן שגרתי כמו הם תשואה מבודד ביואקטיביות להסביר הרבה על חבר הבחירה ואת הבחירה, במיוחד נחשים2.
שומנים בעור יכול להיות מופק או חי העור, העור המחסן, או זוחלים כל מת, באמצעות פולרי או ממיסים אורגניים קוטבית1,7,8,9. יצוין כי דגימות מוזיאון המאוחסן ממיסים כגון אתנול אינם מיטביים על החילוץ של שומנים בעור, פגרי רק טרי או קפוא טרי צריך להיחשב כמקורות אפשריים עבור החילוץ. שומנים בעור שהם מבינים, מה שהופך אותם יציבה על פני השטח של העור, כדי לחלץ7. תפקידיהם איתות זוחלים אקולוגיה, העור השומנים רמזים מופקדים לרוב בסביבות קשות, אך בשל תכונותיהם כימיים חזקים, רמזים כאלה יכולים לשמור על ערכם מידע על פני תקופות ארוכות של זמן10,11 , 12. תהליך החילוץ solubilizes ליפידים, שימוש של ממס פולרי (למשל, הקסאן, בנזן, טולואן) מעל להשרות שעות-לונג, ואחריו האידוי של הממס, לעזוב מסה למדידה של תמצית ליפידים7 , 8. עור שומנים miscible מאוד בממיסים פולרי, מגוון רחב של פחמימנים יכול להיות מופק מערך דומה מגוון של מקורות.
Fractionation היא יותר מאשר חילוץ מפרך אבל מגישה כדי להפריד את תמצית ליפידים הכולל לתוך שברים ספציפי באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, כדי לסייע בזיהוי האפשר וטיהור של תרכובות ובזה1, 6 , 7 , 8. תמצית ליפידים הכולל מאוגד לעמודה מבוססת על המצע, ואז, בודדים eluates (“שברים”) של הממס בעוצמות ספציפיים מועברים ברצף באמצעות העמודה כדי elute קבוצות של תרכובות מעירוב השומנים בעלות משותפת קוטביות6,7,8. הכרומטוגרפיה השומנים, ההתקדמות שברים קוטביות בחלק סטנדרטית רצף על ידי הגדלת הכמות היחסית של הממס קוטביים (למשל, דיאתיל אתר) בממס פולרי (בדרך כלל מבוטא כאחוז: 0%, 2% 4% אתר, ועוד. )6,7,8. על פי שיטות כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) יכול לשמש כדי להפריד בין ליפידים תערובת, הם פשוטים יותר, כרומטוגרפיה עמודה הוא מועדף בגלל שהוא משתמש מערכת סגורה, קל לשלוט, יכול עוד נפרד התרכז תערובות ולאחר תואם ריבוב ליעילות. כתב יד זה, אנחנו מתארים מספר שיטות לחילוץ שומנים בעור של זוחלים ומספקים, ואז, פרוטוקול תקני לבידוד סטים שונים של תרכובות בהתבסס על קוטביות, באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. במיזמי מחקר רבים המערבים את ניתוקה של סימנים כימיים, המטרה הסופית היא ליצור שינוי ב הקולטים נחשפים רמזים אלה. כל השומנים תמציות או שברים ספציפיים, לאחר מכן, ניתן להשתמש ב- bioassays כדי לקבוע שכל פעילות ביולוגית שהפיק תרכובות ובזה1,2,6,7. במחקר ביולוגי בסיסי, לדוגמה, bioassays באמצעות שברים ספציפי יכול לחשוף לחוקרים כי מקור מטוהרים של פרומונים היה מבודד, אז יכול להיות נרדף שיטות הזיהוי של תרכובות היעד. מנקודת מבט ניהול חיות הבר, זיהוי לא יכול להיות המטרה, במקום זאת, השבר הפעילים יכול לשמש בשטח כדי למשוך בני מינו למלכודות או לעכב את חבר מעקב ב13,גידול הכוללים14.
ניתן להחיל החילוץ של העור שומנים ב זוחלים העור חי או מת, בנוסף המחסן העור, אשר מציע צדדיות ביישום ניסיוני של טכניקה זו. יתרה מזאת, עקירות של שומנים בעור יכול להיעשות בשטח, כדי לאפשר יישום דינמי של השיטה למגוון רחב של ביולוגים2,13. מיצוי של שומנים בעור היא פשוטה; לכן, זה קל לשנות את קנה המידה עקירות כנדרש לכל ניסוי או עיצוב, המתרגלים לא צריך מומחיות משמעותי לביצוע השיטות. מקדמי המגביל היחיד אולם שינוי קנה המידה הם הזמינות של fume הוד שטח, שפע של כלי זכוכית נקי, sealable, ושטח אחסון הממס.
העור השומנים תמצית fractionation יכולים להיות מותאמים לצרכים של חוקר ו, לכן, יש גמישות דומה שאיבת שומנים בדם. לדוגמה, ליפידים ניטראלי יכול להיות eluted, ואז נמחק, כתוצאה מכך בחלקים למטרה לטהר תרכובות של עניין או לפשט bioassays. Fractionation יכול להתבצע על קשקשים מרובות בתוך ועל -פני השומנים דגימות. לדוגמה, עמודות מרובות ניתן להפעיל בו זמנית כדי לייעל את התהליך. או, רק על חלק תמצית ליפידים הכולל יכול להיות fractionated על עמודה קטן לחוס, לפיכך, ריאגנטים וזמן. Fractionation מוגבל בעיקר על-ידי המסה של תמצית ליפידים הכולל את מידת הדיוק של הציוד לרשות החוקר. לדוגמה, אם החוקר יש איזון עם דיוק 10.0 מ ג, הקביעה של השבר מסה ו, לכן, הדיוק של הכנת דגימה לניתוח GC-MS באופן משמעותי, אם לא לגמרי, מופרעת. אותו דבר נכון גם לגבי כלי הזכוכית. אם החוקר יש עמודה בנפח גדול עבור fractionation אבל יש מסה השומנים הכולל קטן כדי להפריד, • תנאי או הפרדה של תרכובות יתפתחו אך ידרוש בזבוז משמעותית של ממיסים, ריאגנטים, זמן, באופן פוטנציאלי, המטרה תרכובות עצמם.
מומלץ לבצע בדיקה בקרת איכות לפני שתקבעו את ערכת • תנאי, כפי שניתן לראות בטבלה מס ‘ 2, ולהחליט מה שברים ייתכן ימחקו. כדי לאשר את • תנאי של ליפידים הרצוי, עמודה יכול להיות בניהול איפה כל שבר, 1-15, הוא אסף בנפרד ולאחר מכן נותחו באמצעות GC-MS. איור 3, נציג שמוצאים עקבות להראות מתיל קטונים מ בירית נחשים elute רק מהעמודה בשבריר ספציפיים. על ידי ביצוע שלב בקרת איכות, ערכה ששונה • תנאי יכול להיות מפותח זן מסוים להבטיח מקסימום תשואה של תרכובות של עניין. שינויים החומרים, כגון ספק או הרבה אלומינה או גיל דיאתיל אתר, תגרום בהחלט הבדלים • תנאי זה צריכה להיות נשלטת על-ידי ביצוע מבחן בקרת איכות.
מהטכניקות שתוארו מוגבלים בעיקר על ידי הטבע כימי של המקלות שניתן להשיג. בעיקר, שיטות אלה מאפשרות רק החוקרים לבודד ולהפריד שומנים ארוכי שרשרת מן העור של זוחלים. מינים רבים של זוחלים השתמש ברמזים באוויר ו/או proteinaceous כמו אותות כימיים, השיטות המתואר אינם תואמים עם בידוד רמזים אמר. ממיסים עוד, פולרי לא לחלץ רמזים מימית המשטחים של זוחלים או מקורות של התצהיר הסימן (למשלמים בכלוב, פלומות, המצע מימיים) שעשויים להכיל אכן שופע אותות כימיים. שיטות המתאימות עבור לכידת סוגים אלה של רמזים עומדים לרשות החוקרים (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME] רמזים נדיף ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים [HPLC] למקלות מימית), למרות, כמו השיטות כמתואר לעיל, יש עקומת למידה טכנית.
והכי חשוב, השירות של תערובת כימי הסופי כדי החוקר צריך מדריך בין השיטות. לדוגמה, אם חוקר רוצה לדעת אם חיית מוקדי זכר יכול להבחין בין המקלות המיוצר על ידי זכר מול נקבה בני מינו ב bioassay יישוב, החילוץ היא שהשיטה היחידה צריכה2,3. אם הזיהוי של תרכובות dimorphic מינית היא המטרה, אולם, התמצית חייב להיטהר, כדי לאפשר ביטחון רב יותר בנתינת ההזדהויות מולקולות ספציפיות או לקבוצות של מולקולות דרך ניתוח כימי1, 6,9,11. עם זאת, אפילו לערוך בדיקות עם מקור השומנים, מסה משמעותית של החל תמצית נדרש כדי שבר מדיד מיסות ניתן להשיג; אחרת, איגום של דגימות יכול להיות נרדף אך אינה אופטימלית14.
התפתחויות עתידיות של פרוטוקול זה כוללים אמצעים כדי לנצל ולהתאים את ההליך עבור מינים יותר הזוחלים. שיטות נוספות שבהן לא פולשנית של חילוץ שומנים בעור גם מפותחים.
The authors have nothing to disclose.
פיתוח שיטות אלה, במיוחד המחסן העור השומנים החילוץ, אירעה במהלך הסכמי שיתוף פעולה (14-7412-טאוב למדעי המחשב-CA, 15-7412-1155-CA ו 16-7412-1269-קה) בין ג’יימס מדיסון האוניברסיטה (JMU) חיה החקלאות האמריקאי של צמח הבריאות פיקוח שירות (APHIS). M.R.P. על תרומתם של התלמידים הבאים להתפתחות של השיטות העור המחסן: ס’ פאטל (וושינגטון ו- Lee האוניברסיטה [WLU]), ג’יי. יכול (WLU), ר’ פלורס (JMU), ג’יי נול (JMU) ו ס אשטון (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |